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["無断転載を禁ずる　（国立医薬品食品衛生研究所）"]
["ref_ID","PMID","Animal/Plant\n動物/植物","Species\n種名","Techniques\n用いた技術","Target genes\n標的遺伝子","Journal\n雑誌名","Title\nタイトル","Year\n年","Vol/pages\n巻・号・ページ","Authors\n著者","Affiliations\n所属機関（国）","PMID","DOI","Abstract \n抄録 ","species2","Abstract (Jan)\n日本語抄録"]
[1,30390050,"plant","apple; grapevine","CRISPR;Cas9;"," ","Nature protocols","CRISPR-Cas9-mediated genome editing in apple and grapevine.",2018,"13(12):2844-2863","[Osakabe Y et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",30390050,"10.1038/s41596-018-0067-9 ","The CRISPR-Cas9 genome-editing tool and the availability of whole-genome sequences from plant species have revolutionized our ability to introduce targeted mutations into important crop plants, both to explore genetic changes and to introduce new functionalities. Here, we describe protocols adapting the CRISPR-Cas9 system to apple and grapevine plants, using both plasmid-mediated genome editing and the direct delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins (RNPs) to achieve efficient DNA-free targeted mutations in apple and grapevine protoplasts. We provide a stepwise protocol for the design and transfer of CRISPR-Cas9 components to apple and grapevine protoplasts, followed by verification of highly efficient targeted mutagenesis, and regeneration of plants following the plasmid-mediated delivery of components. Our plasmid-mediated procedure and the direct delivery of CRISPR-Cas9 RNPs can both be utilized to modulate traits of interest with high accuracy and efficiency in apple and grapevine, and could be extended to other crop species. The complete protocol employing the direct delivery of CRISPR-Cas9 RNPs takes as little as 2-3 weeks, whereas the plasmid-mediated procedure takes >3 months to regenerate plants and study the mutations.","apple; grapevine","CRISPR-Cas9ゲノム編集ツールと植物種からの全ゲノム配列の利用可能性は、遺伝的変化を探求し、新しい機能を導入するために、重要な作物植物に標的変異を導入する私たちの能力に革命をもたらしました。ここでは、CRISPR-Cas9システムをリンゴとブドウの植物に適応させるプロトコルについて説明します。プラスミドを介したゲノム編集とCRISPR-Cas9リボ核タンパク質（RNP）の直接送達の両方を使用して、リンゴとブドウのプロトプラストで効率的なDNAフリーの標的変異を実現します。CRISPR-Cas9コンポーネントの設計とアップルおよびグレープバインプロトプラストへの転送、それに続く非常に効率的な標的突然変異誘発の検証、およびプラスミドを介したコンポーネントの送達後の植物の再生のための段階的なプロトコルを提供します。私たちのプラスミドを介した手順とCRISPR-Cas9RNPの直接配信はどちらも、リンゴとブドウの木で目的の特性を高精度かつ効率的に調整するために利用でき、他の作物種にも拡張できます。CRISPR-Cas9 RNPの直接送達を採用する完全なプロトコルは、わずか2〜3週間かかりますが、プラスミドを介した手順では、植物を再生して変異を研究するのに3か月以上かかります。"]
[2,29358212,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","target of monopteros 7 (tmo7)","Development","Regulation of intercellular TARGET OF MONOPTEROS 7 protein transport in the Arabidopsis root.",2018,"145(2)","[Lu KJ  et al.]","Wageningen University, Wageningen, The Netherlands.",29358212,"10.1242/dev.152892 ","Intercellular communication coordinates hypophysis establishment in the Arabidopsis embryo. Previously, TARGET OF MONOPTEROS 7 (TMO7) was reported to be  transported to the hypophysis, the founder cell of the root cap, and RNA suppression experiments implicated its function in embryonic root development. However, the protein properties and mechanisms mediating TMO7 protein transport,  and the role the movement plays in development remained unclear. Here, we report  that in the post-embryonic root, TMO7 and its close relatives are transported into the root cap through plasmodesmata in a sequence-dependent manner. We also show that nuclear residence is crucial for TMO7 transport, and postulate that modification, potentially phosphorylation, labels TMO7 for transport. Additionally, three novel CRISPR/Cas9-induced tmo7 alleles confirmed a role in hypophysis division, but suggest complex redundancies with close relatives in root formation. Finally, we demonstrate that TMO7 transport is biologically meaningful, as local expression partially restores hypophysis division in a plasmodesmal protein transport mutant. Our study identifies motifs and amino acids that are pivotal for TMO7 protein transport, and establishes the importance of TMO7 in hypophysis and root development.","Arabidopsis","細胞間コミュニケーションは、アラビドプシス胚における下垂体の確立を調整します。以前、TARGET OF MONOPTEROS 7（TMO7）は、ルートキャップの創始者細胞である下垂体に輸送されることが報告されており、RNA抑制実験はその機能が胚の根の発達に関係していることを示しています。ただし、TMO7タンパク質の輸送を仲介するタンパク質の特性とメカニズム、および開発において運動が果たす役割は不明なままでした。ここでは、胚後の根において、TMO7とその近縁種が、配列依存的に形質デスマタを介して根のキャップに輸送されることを報告します。また、核内滞留がTMO7輸送にとって重要であることを示し、修飾、潜在的にリン酸化がTMO7を輸送用にラベル付けすると仮定します。さらに、3つの新規CRISPR / Cas9誘導tmo7対立遺伝子は、下垂体分裂における役割を確認しましたが、根の形成に近親者がいる複雑な冗長性を示唆しています。最後に、局所発現が原形質連絡タンパク質輸送変異体の下垂体分裂を部分的に回復するため、TMO7輸送が生物学的に意味があることを示します。私たちの研究は、TMO7タンパク質輸送にとって極めて重要なモチーフとアミノ酸を特定し、下垂体と根の発達におけるTMO7の重要性を確立しています。"]
[3,30327661,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","MYB-CC transcription factor (PHL4)","Frontiers in plant science","Functional Characterization of Arabidopsis PHL4 in Plant Response to Phosphate Starvation.",2018,"9:1432","[Wang Z et al.]","Tsinghua University, Beijing, China.",30327661,"10.3389/fpls.2018.01432 ","Plants have evolved an array of adaptive responses to cope with phosphate (Pi) starvation. These responses are mainly controlled at the transcriptional level. In Arabidopsis, PHR1, a member of the MYB-CC transcription factor family, is a key component of the central regulatory system controlling plant transcriptional  responses to Pi starvation. Its homologs in the MYB-CC family, PHL1 (PHR1-LIKE 1), PHL2, and perhaps also PHL3, act redundantly with PHR1 to regulate plant Pi starvation responses. The functions of PHR1's closest homolog in this family, PHL4, however, have not been characterized due to the lack of its null mutant. In this work, we generated two phl4 null mutants using the CRISPR/Cas9 technique and investigated the functions of PHL4 in plant responses to Pi starvation. The results indicated that the major developmental, physiological, and molecular responses of the phl4 mutants to Pi starvation did not significantly differ from  those of the wild type. By comparing the phenotypes of the phr1 single mutant and phr1phl1 and phr1phl4 double mutants, we found that PHL4 also acts redundantly with PHR1 to regulate plant Pi responses, but that its effects are weaker than those of PHL1. We also found that the overexpression of PHL4 suppresses plant development under both Pi-sufficient and -deficient conditions. Taken together, the results indicate that PHL4 has only a minor role in the regulation of plant responses to Pi starvation and is a negative regulator of plant development.","Arabidopsis","植物は、リン酸（Pi）飢餓に対処するために一連の適応応答を進化させてきました。これらの応答は、主に転写レベルで制御されます。シロイヌナズナでは、MYB-CC転写因子ファミリーのメンバーであるPHR1が、Pi飢餓に対する植物の転写応答を制御する中央調節システムの重要な構成要素です。MYB-CCファミリーのホモログであるPHL1（PHR1-LIKE 1）、PHL2、そしておそらくPHL3も、PHR1と重複して作用し、植物のPi飢餓応答を調節します。しかし、このファミリーで最も近いPHR1のホモログであるPHL4の機能は、そのヌル変異体がないために特徴付けられていません。この作業では、CRISPR / Cas9技術を使用して2つのphl4null変異体を生成し、Pi飢餓に対する植物の応答におけるPHL4の機能を調査しました。結果は、Pi飢餓に対するphl4変異体の主要な発達的、生理学的、および分子的応答が野生型のものと有意に異ならなかったことを示した。phr1単一変異体とphr1phl1およびphr1phl4二重変異体の表現型を比較す​​ることにより、PHL4もPHR1と重複して作用し、植物のPi応答を調節するが、その効果はPHL1よりも弱いことがわかった。また、PHL4の過剰発現は、Piが十分な条件下と不十分な条件下の両方で植物の発育を抑制することもわかりました。まとめると、結果は、PHL4がPi飢餓に対する植物の応答の調節においてわずかな役割しか持たず、植物の発達の負の調節因子であることを示しています。"]
[4,30061908,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","AtDET2; AtDMC1","Frontiers in plant science","The Application of a Meiocyte-Specific CRISPR/Cas9 (MSC) System and a Suicide-MSC System in Generating Inheritable and Stable Mutations in Arabidopsis.",2018,"9:1007","[Xu P et al.]","Fudan University, Shanghai, China.",30061908,"10.3389/fpls.2018.01007 ","The CRISPR/Cas9 system has been widely used for generating targeted mutations in  various species. In Arabidopsis, it largely relies on the edited cells where the  Cas9 protein performs its activity to obtain heritable and stable mutated lines.  Here, we designed an improved CRISPR/Cas9 system, named as the MSC (meiocyte-specific CRISPR/Cas9) system, in which the Cas9 expression is driven by an experimentally approved meiocyte-specific promoter (AtDMC1 promoter). Two endogenous genes, including vegetative gene AtDET2 and reproductive gene AtDMC1,  were targeted. We obtained heterozygous T1 plants for targeted genes with high efficiency (64%). In the T2 generation, the homozygous plants were abundant with  high efficiency (37%). Analysis of Sanger sequencing results of T2 generation revealed that heritable gene mutations were high (52%). Moreover, we showed that  the MSC system could sufficiently delete a middle size DNA fragment ( approximately 500 bp) between two cleavage sites with a high rate (64.15%) in the T1 plants, providing direct evidence for making complete knock-out or certain domain-depletion mutations. In addition, we further made a suicide-MSC system, which can edit the targeted endogenous gene and the exogenous Cas9 gene simultaneously, not only successfully avoiding the further destroy of alleles brought in by molecular complementary or genic allelic test, but also maintaining the stable mutated alleles for functional studies. In short, the two systems provide new approaches to generate mutations for gene functional studies.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9システムは、さまざまな種で標的変異を生成するために広く使用されています。シロイヌナズナでは、Cas9タンパク質がその活性を発揮して遺伝性で安定した変異株を取得する編集済み細胞に大きく依存しています。ここでは、MSC（meiocyte-specific CRISPR / Cas9）システムと呼ばれる改良されたCRISPR / Cas9システムを設計しました。このシステムでは、Cas9の発現は実験的に承認されたmeiocyte-specificプロモーター（AtDMC1プロモーター）によって駆動されます。栄養遺伝子AtDET2と生殖遺伝子AtDMC1を含む2つの内因性遺伝子が標的にされました。標的遺伝子のヘテロ接合T1植物を高効率（64％）で取得しました。T2世代では、ホモ接合性の植物が豊富で高効率（37％）でした。T2世代のサンガーシーケンシング結果の分析により、遺伝性遺伝子変異が高いことが明らかになりました（52％）。さらに、MSCシステムがT1植物の2つの切断部位間の中型DNAフラグメント（約500 bp）を高率（64.15％）で十分に削除できることを示し、完全なノックアウトまたは特定のドメインを作成する直接的な証拠を提供します-枯渇変異。さらに、標的となる内因性遺伝子と外因性Cas9遺伝子を同時に編集できる自殺MSCシステムをさらに作成しました。これにより、分子相補的または遺伝子的対立遺伝子検査によってもたらされる対立遺伝子のさらなる破壊を回避できるだけでなく、安定性を維持することもできます。機能研究のための変異した対立遺伝子。要するに、2つのシステムは、遺伝子機能研究のための突然変異を生成するための新しいアプローチを提供します。"]
[5,29675030,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","glabrous1","Frontiers in plant science","Homology-Directed Repair of a Defective Glabrous Gene in Arabidopsis With Cas9-Based Gene Targeting.",2018,"9:424","[Hahn F et al.]","Heinrich Heine University Dusseldorf, Dusseldorf, Germany.",29675030,"10.3389/fpls.2018.00424 ","The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for targeted genome editing in plants and beyond. Double-strand breaks induced by the Cas9 enzyme are repaired by the cell's own repair machinery either by the non-homologous end joining pathway or by homologous recombination (HR). While the first repair mechanism results in random mutations at the double-strand break site, HR uses the genetic information from a highly homologous repair template as blueprint for repair of the break. By offering an artificial repair template, this pathway can  be exploited to introduce specific changes at a site of choice in the genome. However, frequencies of double-strand break repair by HR are very low. In this study, we compared two methods that have been reported to enhance frequencies of  HR in plants. The first method boosts the repair template availability through the formation of viral replicons, the second method makes use of an in planta gene targeting (IPGT) approach. Additionally, we comparatively applied a nickase  instead of a nuclease for target strand priming. To allow easy, visual detection  of HR events, we aimed at restoring trichome formation in a glabrous Arabidopsis  mutant by repairing a defective glabrous1 gene. Using this efficient visual marker, we were able to regenerate plants repaired by HR at frequencies of 0.12%  using the IPGT approach, while both approaches using viral replicons did not yield any trichome-bearing plants.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9システムは、植物およびそれ以降のターゲットゲノム編集のための強力なツールとして登場しました。Cas9酵素によって誘導される二本鎖切断は、非相同末端結合経路または相同組換え（HR）のいずれかによって、細胞自体の修復機構によって修復されます。最初の修復メカニズムでは二本鎖切断部位にランダムな変異が生じますが、HRは、切断の修復の青写真として、相同性の高い修復テンプレートからの遺伝情報を使用します。人工修復テンプレートを提供することにより、この経路を利用して、ゲノム内の選択した部位に特定の変化を導入することができます。ただし、HRによる二本鎖切断修復の頻度は非常に低いです。この研究では、植物のHRの頻度を高めることが報告されている2つの方法を比較しました。最初の方法はウイルスレプリコンの形成を通じて修復テンプレートの可用性を高め、2番目の方法は植物内遺伝子ターゲティング（IPGT）アプローチを利用します。さらに、ターゲット鎖のプライミングには、ヌクレアーゼの代わりにニッカーゼを比較的適用しました。HRイベントの簡単な視覚的検出を可能にするために、欠陥のあるglabrous1遺伝子を修復することにより、グラブラスシロイヌナズナ変異体の毛状突起形成を回復することを目指しました。この効率的な視覚的マーカーを使用して、IPGTアプローチを使用して0.12％の頻度でHRによって修復された植物を再生することができましたが、ウイルスレプリコンを使用した両方のアプローチでは毛状突起を有する植物は生成されませんでした。"]
[6,30266091,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","AGO1; AP1; TT4","Genome biology","Manipulating plant RNA-silencing pathways to improve the gene editing efficiency  of CRISPR/Cas9 systems.",2018,"19(1):149","[Mao Y et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30266091,"10.1186/s13059-018-1529-7 ","BACKGROUND: The CRISPR/Cas9 system, composed of a single-guide RNA for target recognition and a Cas9 protein for DNA cleavage, has the potential to revolutionize agriculture as well as medicine. Even though extensive work has been done to improve the gene editing activity of CRISPR/Cas9, little is known about the regulation of this bacterial system in eukaryotic host cells, especially at the post-transcriptional level. RESULTS: Here, we evaluate the expression levels of the two CRISPR/Cas9 components and the gene editing efficiency in a set of Arabidopsis mutants involved in RNA silencing. We find that mutants defective in the post-transcriptional gene-silencing pathway display significantly higher Cas9 and sgRNA transcript levels, resulting in higher mutagenesis frequencies than wild-type controls. Accordingly, silencing of AGO1 by introduction of an AGO1-RNAi cassette into the CRISPR/Cas9 vector provides an  increase in gene editing efficiency. Co-expression of the viral suppressor p19 from the tomato bushy stunt virus to suppress the plant RNA-silencing pathway shows a strong correlation between the severity of the phenotypic effects caused  by p19 and the gene editing efficiency of the CRISPR/Cas9 system for two different target genes, AP1 and TT4. CONCLUSIONS: This system has useful practical applications in facilitating the detection of CRISPR/Cas9-induced mutations in T1 plants as well as the identification of transgene-free T2 plants  by simple visual observation of the symptom severity caused by p19. Our study shows that CRISPR/Cas9 gene editing efficiency can be improved by reducing RNA silencing in plants.","Arabidopsis","背景：ターゲット認識用のシングルガイドRNAとDNA切断用のCas9タンパク質で構成されるCRISPR / Cas9システムは、農業と医学に革命をもたらす可能性を秘めています。CRISPR / Cas9の遺伝子編集活性を改善するために広範な研究が行われてきましたが、真核生物の宿主細胞におけるこの細菌系の調節について、特に転写後のレベルではほとんど知られていません。結果：ここでは、2つのCRISPR / Cas9コンポーネントの発現レベルと、RNAサイレンシングに関与する一連のArabidopsis変異体における遺伝子編集効率を評価します。転写後の遺伝子サイレンシング経路に欠陥のある変異体は、Cas9およびsgRNAの転写レベルが大幅に高くなり、野生型コントロールよりも変異誘発頻度が高くなることがわかりました。したがって、AGO1-RNAiカセットをCRISPR / Cas9ベクターに導入することによるAGO1のサイレンシングは、遺伝子編集効率の向上をもたらします。トマトブッシースタントウイルスからのウイルスサプレッサーp19を共発現させて、植物のRNAサイレンシング経路を抑制することは、p19によって引き起こされる表現型効果の重症度と、2つの異なるCRISPR / Cas9システムの遺伝子編集効率との間に強い相関関係があることを示しています。ターゲット遺伝子、AP1およびTT4。結論：このシステムは、T1植物におけるCRISPR / Cas9誘発性変異の検出、およびp19によって引き起こされる症状の重症度の単純な視覚的観察による導入遺伝子を含まないT2植物の同定を容易にするのに有用な実用的アプリケーションを持っています。私たちの研究は、CRISPR / Cas9遺伝子編集効率が植物のRNAサイレンシングを減らすことによって改善できることを示しています。"]
[7,30544514,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","International journal of molecular sciences","A Highly Efficient Cell Division-Specific CRISPR/Cas9 System Generates Homozygous Mutants for Multiple Genes in Arabidopsis.",2018,"19(12)","[Feng Z et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30544514,"10.3390/ijms19123925 ","The CRISPR/Cas9 system has been widely used for targeted genome editing in numerous plant species. In Arabidopsis, constitutive promoters usually result in  a low efficiency of heritable mutation in the T1 generation. In this work, CRISPR/Cas9 gene editing efficiencies using different promoters to drive Cas9 expression were evaluated. Expression of Cas9 under the constitutive CaMV 35S promoter resulted in a 2.3% mutation rate in T1 plants and failed to produce homozygous mutations in the T1 and T2 generations. In contrast, expression of Cas9 under two cell division-specific promoters, YAO and CDC45, produced mutation rates of 80.9% to 100% in the T1 generation with nonchimeric mutations in the T1  (4.4(-)10%) and T2 (32.5(-)46.1%) generations. The pCDC45 promoter was used to modify a previously reported multiplex CRISPR/Cas9 system, replacing the original constitutive ubiquitin promoter. The multi-pCDC45-Cas9 system produced higher mutation efficiencies than the multi-pUBQ-Cas9 system in the T1 generation (60.17% vs. 43.71%) as well as higher efficiency of heritable mutations (11.30% vs. 4.31%). Sextuple T2 homozygous mutants were identified from a construct targeting seven individual loci. Our results demonstrate the advantage of using cell division promoters for CRISPR/Cas9 gene editing applications in Arabidopsis, especially in multiplex applications.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9システムは、多くの植物種のターゲットゲノム編集に広く使用されています。アラビドプシスでは、構成的プロモーターは通常、T1世代の遺伝性変異の効率を低下させます。この作業では、Cas9の発現を促進するためにさまざまなプロモーターを使用したCRISPR / Cas9遺伝子編集効率を評価しました。構成的CaMV35Sプロモーター下でのCas9の発現は、T1植物で2.3％の突然変異率をもたらし、T1およびT2世代でホモ接合性突然変異を生成することができませんでした。対照的に、2つの細胞分裂特異的プロモーター、YAOおよびCDC45の下でのCas9の発現は、T1（4.4（-）10％）およびT2（32.5（32.5（32.5（32.5（32.5（） -）46.1％）世代。pCDC45プロモーターを使用して、以前に報告されたマルチプレックスCRISPR / Cas9システムを変更し、元の構成的ユビキチンプロモーターを置き換えました。multi-pCDC45-Cas9システムは、T1世代のmulti-pUBQ-Cas9システムよりも高い突然変異効率（60.17％対43.71％）と、遺伝性突然変異の高い効率（11.30％対4.31％）を生み出しました。六重T2ホモ接合変異体は、7つの個々の遺伝子座をターゲットとするコンストラクトから識別されました。私たちの結果は、シロイヌナズナのCRISPR / Cas9遺伝子編集アプリケーション、特にマルチプレックスアプリケーションに細胞分裂プロモーターを使用することの利点を示しています。"]
[8,29575603,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","three catalase genes (CAT1; CAT2; CAT3)","Journal of integrative plant biology","The Arabidopsis catalase triple mutant reveals important roles of catalases and peroxisome-derived signaling in plant development.",2018,"60(7):591-607","[Su T et al.]","Shandong Normal University, Jinan, China.",29575603,"10.1111/jipb.12649 ","Hydrogen peroxide (H2 O2 ) is generated in many metabolic processes. As a signaling molecule, H2 O2 plays important roles in plant growth and development,  as well as environmental stress response. In Arabidopsis, there are three catalase genes, CAT1, CAT2, and CAT3. The encoded catalases are predominately peroxisomal proteins and are critical for scavenging H2 O2 . Since CAT1 and CAT3  are linked on chromosome 1, it has been almost impossible to generate cat1/3 and  cat1/2/3 mutants by traditional genetic tools. In this study, we constructed cat1/3 double mutants and cat1/2/3 triple mutants by CRISPR/Cas9 to investigate the role of catalases. The cat1/2/3 triple mutants displayed severe redox disturbance and growth defects under physiological conditions compared with wild-type and the cat2/3 double mutants. Transcriptome analysis showed a more profound transcriptional response in the cat1/2/3 triple mutants compared to the  cat2/3 mutants. These differentially expressed genes are involved in plant growth regulation as well as abiotic and biotic stress responses. In addition, expression of OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL INDUCIBLE 1) and several MAPK cascade genes  were changed dramatically in the catalase triple mutant, suggesting that H2 O2 produced in peroxisomes could serve as a peroxisomal retrograde signal.","Arabidopsis","過酸化水素（H2 O2）は多くの代謝過程で生成されます。シグナル伝達分子として、H2 O2は、植物の成長と発達、および環境ストレス応答において重要な役割を果たします。シロイヌナズナには、CAT1、CAT2、CAT3の3つのカタラーゼ遺伝子があります。コード化されたカタラーゼは主にペルオキシソームタンパク質であり、H2O2を除去するために重要です。CAT1とCAT3は染色体1でリンクされているため、従来の遺伝子ツールではcat1 / 3とcat1 / 2/3の変異体を生成することはほとんど不可能でした。この研究では、カタラーゼの役割を調査するために、CRISPR / Cas9によってcat1 / 3二重変異体とcat1 / 2/3三重変異体を構築しました。cat1 / 2/3トリプル変異体は、野生型およびcat2 / 3ダブル変異体と比較して、生理学的条件下で重度の酸化還元障害および成長欠陥を示しました。トランスクリプトーム解析は、cat2 / 3変異体と比較してcat1 / 2/3トリプル変異体でより深い転写応答を示しました。これらの差次的に発現する遺伝子は、植物の成長調節、ならびに非生物的および生物的ストレス応答に関与しています。さらに、OXI1（OXIDATIVE SIGNAL INDUCIBLE 1）といくつかのMAPKカスケード遺伝子の発現がカタラーゼトリプル変異体で劇的に変化し、ペルオキシソームで生成されたH2O2がペルオキシソーム逆行性シグナルとして機能する可能性があることを示唆しています。"]
[9,29226588,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","AtRPL10A; AtRPL10B; AtRPL10C","Journal of integrative plant biology","Multigene editing via CRISPR/Cas9 guided by a single-sgRNA seed in Arabidopsis.",2018,"60(5):376-381","[Yu Z et al.]","Hangzhou Normal University, Hangzhou, China.",29226588,"10.1111/jipb.12622 ","We report that a solo single-guide RNA (sgRNA) seed is capable of guiding Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR -associated 9 (CRISRP/Cas9) to simultaneously edit multiple genes AtRPL10A, AtRPL10B and AtRPL10C in Arabidopsis. Our results also demonstrate that it is possible to use CRISPR/Cas9 technology to create AtRPL10 triple mutants which otherwise cannot be generated by conventional genetic crossing. Compared to other conventional multiplex CRISPR/Cas systems, a single sgRNA seed has the advantage  of reducing off-target gene-editing. Such a gene editing system might be also applicable to modify other homologous genes, or even less-homologous sequences for multiple gene-editing in plants and other organisms.","Arabidopsis","ソロシングルガイドRNA（sgRNA）シードは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（CRISRP / Cas9）をガイドして、シロイヌナズナの複数の遺伝子AtRPL10A、AtRPL10B、AtRPL10Cを同時に編集できることを報告します。我々の結果はまた、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、従来の遺伝子交雑では生成できないAtRPL10トリプル変異体を作成することが可能であることを示しています。他の従来のマルチプレックスCRISPR / Casシステムと比較して、単一のsgRNAシードにはオフターゲット遺伝子編集を減らすという利点があります。このような遺伝子編集システムは、他の相同遺伝子、または植物や他の生物における複数の遺伝子編集のためのより相同性の低い配列を改変するためにも適用できる可能性があります。"]
[10,29773790,"plant","Arabidopsis","Cas9;"," ","Nature communications","CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Arabidopsis using sequential transformation.",2018,"9(1):1967","[Miki D et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",29773790,"10.1038/s41467-018-04416-0 ","Homologous recombination-based gene targeting is a powerful tool for precise genome modification and has been widely used in organisms ranging from yeast to higher organisms such as Drosophila and mouse. However, gene targeting in higher  plants, including the most widely used model plant Arabidopsis thaliana, remains  challenging. Here we report a sequential transformation method for gene targeting in Arabidopsis. We find that parental lines expressing the bacterial endonuclease Cas9 from the egg cell- and early embryo-specific DD45 gene promoter can improve  the frequency of single-guide RNA-targeted gene knock-ins and sequence replacements via homologous recombination at several endogenous sites in the Arabidopsis genome. These heritable gene targeting can be identified by regular PCR. Our approach enables routine and fine manipulation of the Arabidopsis genome.","Arabidopsis","相同組換えベースの遺伝子ターゲティングは、正確なゲノム修飾のための強力なツールであり、酵母からショウジョウバエやマウスなどの高等生物に至るまで、広く使用されています。ただし、最も広く使用されているモデル植物シロイヌナズナを含む高等植物の遺伝子ターゲティングは、依然として困難です。ここでは、シロイヌナズナにおける遺伝子ターゲティングの順次形質転換法を報告します。卵細胞および初期胚特異的DD45遺伝子プロモーターから細菌エンドヌクレアーゼCas9を発現する親系統は、シングルガイドRNAを標的とした遺伝子ノックインの頻度と、内因性部位での相同組換えを介した配列置換を改善できることがわかりました。アラビドプシスゲノム。これらの遺伝性遺伝子ターゲティングは、通常のPCRによって特定できます。私たちのアプローチは、Arabidopsisゲノムの日常的かつ細かい操作を可能にします。"]
[11,29385529,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","Plant & cell physiology","BES1 and BZR1 Redundantly Promote Phloem and Xylem Differentiation.",2018,"59(3):590-600","[Saito M et al.]","University of Tokyo, Tokyo, Japan.",29385529,"10.1093/pcp/pcy012 ","Vascular development is a good model for studying cell differentiation in plants. Two conductive tissues, the xylem and phloem, are derived from common stem cells  known as procambial/cambial cells. Glycogen synthase kinase 3 proteins (GSK3s) play crucial roles in maintaining procambial/cambial cells by suppressing their differentiation into xylem or phloem cells. We previously designed an in vitro culture system for analyzing vascular cell differentiation named VISUAL (Vascular cell Induction culture System Using Arabidopsis Leaves). Using this system, we found that the transcription factor BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1 (BES1) functions as a downstream target of GSK3s during xylem differentiation. However, the function of BES1 in vascular development remains largely unknown. Here, we found that, in addition to xylem differentiation, BES1 positively regulates phloem differentiation downstream of GSK3s. Transcriptome analysis using VISUAL confirmed that BES1 promotes bi-directional differentiation of procambial cells into xylem and phloem cells. Genetic analysis of loss-of-function mutants newly generated using the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) system revealed that BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1), the closest homolog of BES1, functions in vascular development redundantly with BES1. Notably, BZR1 has a weaker impact on  vascular cell differentiation than BES1, suggesting that they contribute differentially to this process. In conclusion, our findings indicate that BES1 and BZR1 are key regulators of both xylem and phloem cell differentiation from vascular stem cells.","Arabidopsis","血管の発達は、植物の細胞分化を研究するための良いモデルです。2つの導電性組織、xylemとphloemは、前庭/前庭細胞として知られる一般的な幹細胞に由来します。グリコーゲンシンターゼキナーゼ3タンパク質（GSK3）は、木部または師部細胞への分化を抑制することにより、形成層/形成層細胞を維持する上で重要な役割を果たします。以前、VISUAL（アラビドプシスの葉を使用した血管細胞誘導培養システム）という名前の血管細胞分化を分析するためのinvitro培養システムを設計しました。このシステムを使用して、転写因子BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1（BES1）が木部分化中にGSK3の下流ターゲットとして機能することを発見しました。ただし、血管の発達におけるBES1の機能はほとんど知られていません。ここでは、木部分化に加えて、BES1がGSK3の下流の師部分化を積極的に調節することを発見しました。VISUALを使用したトランスクリプトーム分析により、BES1が前庭細胞のキシレム細胞とフロム細胞への双方向の分化を促進することが確認されました。CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）システムを使用して新たに生成された機能喪失変異体の遺伝子分析により、BES1の最も近いホモログであるBRASSINAZOLE RESISTANT 1（BZR1）が血管発達において機能することが明らかになりましたBES1と重複して。特に、BZR1はBES1よりも血管細胞の分化への影響が弱く、このプロセスに異なって寄与することを示唆しています。結論として、我々の発見は、BES1とBZR1が血管幹細胞からのキシレムとフロエム細胞の両方の分化の重要な調節因子であることを示しています。"]
[12,29331085,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","DNA sequence-specific H3K27 demethylase (REF6)","Plant biotechnology journal","Verification of DNA motifs in Arabidopsis using CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis.",2018,"16(8):1446-1451","[Li C  et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",29331085,"10.1111/pbi.12886 ","Transcription factors (TFs) and chromatin-modifying factors (CMFs) access chromatin by recognizing specific DNA motifs in their target genes. Chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-seq) has been widely used to discover the potential DNA-binding motifs for both TFs and CMFs. Yet, an in vivo method for verifying DNA motifs captured by ChIP-seq is lacking in plants. Here, we describe the use of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) to verify DNA motifs in their native genomic context in Arabidopsis. Using a single-guide RNA (sgRNA) targeting the DNA motif bound by REF6, a DNA sequence-specific H3K27 demethylase  in plants, we generated stable transgenic plants where the motif was disrupted in a REF6 target gene. We also deleted a cluster of multiple motifs from another REF6 target gene using a pair of sgRNAs, targeting upstream and downstream regions of the cluster, respectively. We demonstrated that endogenous genes with  motifs disrupted and/or deleted become inaccessible to REF6. This strategy should be widely applicable for in vivo verification of DNA motifs identified by ChIP-seq in plants.","Arabidopsis","転写因子（TF）とクロマチン修飾因子（CMF）は、標的遺伝子の特定のDNAモチーフを認識することによってクロマチンにアクセスします。クロマチン免疫沈降とそれに続く次世代シーケンシング（ChIP-seq）は、TFとCMFの両方の潜在的なDNA結合モチーフを発見するために広く使用されています。それでも、ChIP-seqによってキャプチャされたDNAモチーフを検証するためのinvivoメソッドは植物に欠けています。ここでは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（Cas9）を使用して、シロイヌナズナのネイティブゲノムコンテキストでDNAモチーフを検証する方法について説明します。植物のDNA配列特異的H3K27デメチラーゼであるREF6が結合するDNAモチーフを標的とするシングルガイドRNA（sgRNA）を使用して、モチーフがREF6標的遺伝子で破壊された安定したトランスジェニック植物を生成しました。また、sgRNAのペアを使用して、別のREF6ターゲット遺伝子から複数のモチーフのクラスターを削除し、クラスターの上流領域と下流領域をそれぞれターゲットにしました。モチーフが破壊および/または削除された内因性遺伝子がREF6にアクセスできなくなることを示しました。この戦略は、植物のChIP-seqによって識別されたDNAモチーフのinvivo検証に広く適用できるはずです。"]
[13,29752751,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","RNA Polymerase II's largest subunit (RPB1)","Plant journal","Intact Arabidopsis RPB1 functions in stem cell niches maintenance and cell cycling control.",2018,"95(1):150-167","[Zhang QQ et al.]","Shandong Agricultural University, Tai'an, China.",29752751,"10.1111/tpj.13939 ","Plant meristem activity depends on accurate execution of transcriptional networks required for establishing optimum functioning of stem cell niches. An Arabidopsis mutant card1-1 (constitutive auxin response with DR5:GFP) that encodes a truncated RPB1 (RNA Polymerase II's largest subunit) with shortened C-terminal domain (CTD) was identified. Phosphorylation of the CTD repeats of RPB1 is coupled to transcription in eukaryotes. Here we uncover that the truncated CTD of RPB1 disturbed cell cycling and enlarged the size of shoot and root meristem. The defects in patterning of root stem cell niche in card1-1 indicates that intact CTD of RPB1 is necessary for fine-tuning the specific expression of genes responsible for cell-fate determination. The gene-edited plants with different CTD length of RPB1, created by CRISPR-CAS9 technology, confirmed that both the full length and the DK-rich tail of RPB1's CTD play roles in the accurate transcription of CYCB1;1 encoding a cell-cycle marker protein in root meristem and hence participate in maintaining root meristem size. Our experiment proves that the intact RPB1 CTD is necessary for stem cell niche maintenance, which is mediated by transcriptional regulation of cell cycling genes.","Arabidopsis","植物メリステム活性は、幹細胞ニッチの最適な機能を確立するために必要な転写ネットワークの正確な実行に依存します。短縮されたC末端ドメイン（CTD）を持つ切り捨てられたRPB1（RNAポリメラーゼIIの最大のサブユニット）をコードするシロイヌナズナ変異体card1-1（DR5：GFPによる構成的オーキシン応答）が同定されました。RPB1のCTDリピートのリン酸化は、真核生物の転写と関連しています。ここでは、RPB1の切り捨てられたCTDが細胞循環を妨害し、シュートと根の分裂組織のサイズを拡大したことを明らかにします。card1-1のルート幹細胞ニッチのパターン化の欠陥は、RPB1の完全なCTDが、細胞運命決定に関与する遺伝子の特定の発現を微調整するために必要であることを示しています。CRISPR-CAS9テクノロジーによって作成されたRPB1のCTD長が異なる遺伝子編集植物は、RPB1のCTDの全長とDKが豊富なテールの両方が、細胞サイクルマーカーをコードするCYCB1; 1の正確な転写に役割を果たすことを確認しました。ルートメリステムのタンパク質、したがってルートメリステムサイズの維持に関与します。私たちの実験は、無傷のRPB1 CTDが、細胞循環遺伝子の転写調節によって媒介される幹細胞ニッチの維持に必要であることを証明しています。"]
[14,29660180,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","Plant journal","A chromatin loop represses WUSCHEL expression in Arabidopsis.",2018,"94(6):1083-1097","[Guo L et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Shijiazhuang, China.",29660180,"10.1111/tpj.13921 ","WUSCHEL (WUS) is critical for plant meristem maintenance and determinacy in Arabidopsis, and the regulation of its spatiotemporal expression patterns is complex. We previously found that AGAMOUS (AG), a key MADS-domain transcription factor in floral organ identity and floral meristem determinacy, can directly suppress WUS expression through the recruitment of the Polycomb group (PcG) protein TERMINAL FLOWER 2 (TFL2, also known as LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1, LHP1) at the WUS locus; however, the mechanism by which WUS is repressed remains  unclear. Here, using chromosome conformation capture (3C) and chromatin immunoprecipitation 3C, we found that two specific regions flanking the WUS gene  body bound by AG and TFL2 form a chromatin loop that is directly promoted by AG during flower development in a manner independent of the physical distance and sequence content of the intervening region. Moreover, AG physically interacts with TFL2, and TFL2 binding to the chromatin loop is dependent on AG. Transgenic  and CRISPR/Cas9-edited lines showed that the WUS chromatin loop represses gene expression by blocking the recruitment of RNA polymerase II at the locus. The findings uncover the WUS chromatin loop as another regulatory mechanism controlling WUS expression, and also shed light on the factors required for chromatin conformation change and their recruitment.","Arabidopsis","WUSCHEL（WUS）は、シロイヌナズナの植物メリステムの維持と決定性にとって重要であり、その時空間的発現パターンの調節は複雑です。花器官の同一性と花のメリステム決定性における重要なMADSドメイン転写因子であるAGAMOUS（AG）は、ポリコームグループ（PcG）タンパク質TERMINAL FLOWER 2（TFL2、別名WUS遺伝子座のヘテロクロマチンタンパク質1、LHP1のように; ただし、WUSが抑圧されるメカニズムは不明なままです。ここでは、染色体コンフォメーションキャプチャ（3C）とクロマチン免疫沈降3Cを使用して、AGとTFL2が結合するWUS遺伝子本体に隣接する2つの特定の領域が、物理的に独立した方法で花の発達中にAGによって直接促進されるクロマチンループを形成することを発見しました。介在領域の距離とシーケンスコンテンツ。さらに、AGはTFL2と物理的に相互作用し、クロマチンループへのTFL2の結合はAGに依存します。トランスジェニックおよびCRISPR / Cas9で編集された系統は、WUSクロマチンループが遺伝子座でのRNAポリメラーゼIIの動員をブロックすることによって遺伝子発現を抑制することを示しました。調査結果は、WUS発現を制御する別の調節メカニズムとしてWUSクロマチンループを明らかにし、クロマチンコンフォメーションの変化とそれらの動員に必要な要因にも光を当てます。"]
[15,29573495,"plant","Arabidopsis","Cas9;","acetolactate synthase","Plant journal","Efficient in planta gene targeting in Arabidopsis using egg cell-specific expression of the Cas9 nuclease of Staphylococcus aureus.",2018,"94(4):735-746","[Wolter F et al.]","Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany.",29573495,"10.1111/tpj.13893 ","Gene targeting (GT), the programmed change of genomic sequences by homologous recombination (HR), is still a major challenge in plants. We previously developed an in planta GT strategy by simultaneously releasing from the genome a dsDNA donor molecule and creating a double-stranded break (DSB) at a specific site within the targeted gene. Using Cas9 form Streptococcus pyogenes (SpCas9) under the control of a ubiquitin gene promoter, we obtained seeds harbouring GT events, although at a low frequency. In the present research we tested different developmentally controlled promotors and different kinds of DNA lesions for their ability to enhance GT of the acetolactate synthase (ALS) gene of Arabidopsis. For this purpose, we used Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) nuclease and the SpCas9 nickase in various combinations. Thus, we analysed the effect of single-stranded  break (SSB) activation of a targeted gene and/or the HR donor region. Moreover, we tested whether DSBs with 5' or 3' overhangs can improve in planta GT. Interestingly, the use of the SaCas9 nuclease controlled by an egg cell-specific  promoter was the most efficient: depending on the line, in the very best case 6%  of all seeds carried GT events. In a third of all lines, the targeting occurred around the 1% range of the tested seeds. Molecular analysis revealed that in about half of the cases perfect HR of both DSB ends occurred. Thus, using the improved technology, it should now be feasible to introduce any directed change into the Arabidopsis genome at will.","Arabidopsis","相同組換え（HR）によるゲノム配列のプログラムされた変化である遺伝子ターゲティング（GT）は、依然として植物の主要な課題です。以前、dsDNAドナー分子をゲノムから同時に放出し、標的遺伝子内の特定の部位に二本鎖切断（DSB）を作成することにより、プランタ内GT戦略を開発しました。ユビキチン遺伝子プロモーターの制御下でCas9フォームStreptococcuspyogenes（SpCas9）を使用して、低頻度ではありますが、GTイベントを含む種子を取得しました。本研究では、アラビドプシスのアセトラクテートシンターゼ（ALS）遺伝子のGTを増強する能力について、さまざまな発達的に制御されたプロモーターとさまざまな種類のDNA病変をテストしました。この目的のために、黄色ブドウ球菌のCas9（SaCas9）ヌクレアーゼとSpCas9ニッカーゼをさまざまな組み合わせで使用しました。したがって、標的遺伝子および/またはHRドナー領域の一本鎖切断（SSB）活性化の影響を分析しました。さらに、5 'または3'のオーバーハングを持つDSBがプランタGTで改善できるかどうかをテストしました。興味深いことに、卵細胞特異的プロモーターによって制御されるSaCas9ヌクレアーゼの使用が最も効率的でした。系統にもよりますが、最良の場合、すべての種子の6％がGTイベントを運びました。すべての系統の3分の1で、ターゲティングはテストされた種子の1％の範囲で発生しました。分子分析により、約半数のケースで、DSBの両端の完全なHRが発生したことが明らかになりました。したがって、改良された技術を使用して、シロイヌナズナのゲノムに任意の方向性のある変化を自由に導入することが可能になるはずです。"]
[16,29476306,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","Plant molecular biology","Potential high-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis and its prevention.",2018,"96(4-5):445-456","[Zhang Q et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29476306,"10.1007/s11103-018-0709-x ","KEY MESSAGE: We present novel observations of high-specificity SpCas9 variants, sgRNA expression strategies based on mutant sgRNA scaffold and tRNA processing system, and CRISPR/Cas9-mediated T-DNA integrations. Specificity of CRISPR/Cas9 tools has been a major concern along with the reports of their successful applications. We report unexpected observations of high frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in T1 Arabidopsis mutants although the sgRNA was predicted to have a high specificity score. We also present evidence that the off-target effects were further exacerbated in the T2 progeny. To prevent the off-target effects, we tested and optimized two strategies in Arabidopsis, including introduction of a mCherry cassette for a simple and reliable isolation  of Cas9-free mutants and the use of highly specific mutant SpCas9 variants. Optimization of the mCherry vectors and subsequent validation found that fusion of tRNA with the mutant rather than the original sgRNA scaffold significantly improves editing efficiency. We then examined the editing efficiency of eight high-specificity SpCas9 variants in combination with the improved tRNA-sgRNA fusion strategy. Our results suggest that highly specific SpCas9 variants require a higher level of expression than their wild-type counterpart to maintain high editing efficiency. Additionally, we demonstrate that T-DNA can be inserted into  the cleavage sites of CRISPR/Cas9 targets with high frequency. Altogether, our results suggest that in plants, continuous attention should be paid to off-target effects induced by CRISPR/Cas9 in current and subsequent generations, and that the tools optimized in this report will be useful in improving genome editing efficiency and specificity in plants and other organisms.","Arabidopsis","重要なメッセージ：高特異性SpCas9バリアント、変異型sgRNAスキャフォールドとtRNAプロセッシングシステムに基づくsgRNA発現戦略、およびCRISPR / Cas9を介したT-DNA統合の新しい観察結果を紹介します。CRISPR / Cas9ツールの特異性は、それらの成功したアプリケーションの報告とともに主要な関心事でした。sgRNAは高い特異性スコアを持つと予測されましたが、T1シロイヌナズナ変異体でCRISPR / Cas9によって誘導される高頻度のオフターゲット変異誘発の予期しない観察を報告します。また、オフターゲット効果がT2子孫でさらに悪化したという証拠を提示します。オフターゲット効果を防ぐために、Cas9フリー変異体のシンプルで信頼性の高い分離のためのmCherryカセットの導入と、非常に特異的な変異体SpCas9変異体の使用を含む、Arabidopsisでの2つの戦略をテストおよび最適化しました。mCherryベクターの最適化とその後の検証により、tRNAと元のsgRNA足場ではなく変異体との融合により、編集効率が大幅に向上することがわかりました。次に、改良されたtRNA-sgRNA融合戦略と組み合わせた8つの高特異性SpCas9バリアントの編集効率を調べました。我々の結果は、非常に特異的なSpCas9変異体は、高い編集効率を維持するために、野生型の変異体よりも高いレベルの発現を必要とすることを示唆しています。さらに、T-DNAをCRISPR / Cas9ターゲットの切断部位に高頻度で挿入できることを示します。全体として、私たちの結果は、植物では、現在および後続の世代でCRISPR / Cas9によって誘発されるオフターゲット効果に継続的な注意を払う必要があり、このレポートで最適化されたツールが植物のゲノム編集効率と特異性の改善に役立つことを示唆しています。および他の生物。"]
[17,29572390,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","methionine (Met) adenosyltransferase 4 (MAT4)","Plant physiology","METHIONINE ADENOSYLTRANSFERASE4 Mediates DNA and Histone Methylation.",2018,"177(2):652-670","[Meng J et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29572390,"10.1104/pp.18.00183 ","DNA and histone methylation coregulate heterochromatin formation and gene silencing in animals and plants. To identify factors involved in maintaining gene silencing, we conducted a forward genetic screen for mutants that release the silenced transgene Pro35S::NEOMYCIN PHOSPHOTRANSFERASE II in the transgenic Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) line L119 We identified MAT4/SAMS3/MTO3/AT3G17390, which encodes methionine (Met) adenosyltransferase 4 (MAT4)/S-adenosyl-Met synthetase 3 that catalyzes the synthesis of S-adenosyl-Met (SAM) in the one-carbon metabolism cycle. mat4 mostly decreases CHG and CHH DNA methylation and histone H3K9me2 and reactivates certain silenced transposons. The exogenous addition of SAM partially rescues the epigenetic defects of mat4 SAM content and DNA methylation were reduced more in mat4 than in three other mat mutants. MAT4 knockout mutations generated by CRISPR/Cas9 were lethal, indicating that MAT4 is an essential gene in Arabidopsis. MAT1, 2, and 4 proteins exhibited  nearly equal activity in an in vitro assay, whereas MAT3 exhibited higher activity. The native MAT4 promoter driving MAT1, 2, and 3 cDNA complemented the mat4 mutant. However, most mat4 transgenic lines carrying native MAT1, 2, and 3 promoters driving MAT4 cDNA did not complement the mat4 mutant because of their lower expression in seedlings. Genetic analyses indicated that the mat1mat4 double mutant is dwarfed and the mat2mat4 double mutant was nonviable, while mat1mat2 showed normal growth and fertility. These results indicate that MAT4 plays a predominant role in SAM production, plant growth, and development. Our findings provide direct evidence of the cooperative actions between metabolism and epigenetic regulation.","Arabidopsis","DNAとヒストンのメチル化は、動物と植物のヘテロクロマチン形成と遺伝子サイレンシングを共調節します。遺伝子サイレンシングの維持に関与する要因を特定するために、トランスジェニックアラビドプシス（Arabidopsisthaliana）系統L119でサイレンシングされた導入遺伝子Pro35S :: NEOMYCIN PHOSPHOTRANSFERASEIIを放出する変異体のフォワード遺伝子スクリーニングを実施しました。 1炭素代謝サイクルでS-アデノシル-Met（SAM）の合成を触媒するメチオニン（Met）アデノシルトランスフェラーゼ4（MAT4）/ S-アデノシル-Metシンテターゼ3。mat4は、主にCHGおよびCHH DNAメチル化とヒストンH3K9me2を減少させ、特定の沈黙したトランスポゾンを再活性化します。SAMの外因性添加は、mat4 SAM含有量のエピジェネティックな欠陥を部分的に救済し、DNAメチル化は他の3つのmat変異体よりもmat4でより減少しました。CRISPR / Cas9によって生成されたMAT4ノックアウト変異は致命的であり、MAT4がArabidopsisの必須遺伝子であることを示しています。MAT1、2、および4タンパク質は、in vitroアッセイでほぼ同等の活性を示しましたが、MAT3はより高い活性を示しました。MAT1、2、および3のcDNAを駆動するネイティブMAT4プロモーターは、mat4変異体を補完しました。ただし、MAT4 cDNAを駆動するネイティブMAT1、2、および3プロモーターを運ぶほとんどのmat4トランスジェニック系統は、実生での発現が低いため、mat4変異体を補完しませんでした。遺伝子解析は、mat1mat4二重変異体が矮小化され、mat2mat4二重変異体が生存不能であったのに対し、mat1mat2は正常な成長と繁殖力を示したことを示しました。これらの結果は、MAT4がSAMの生産、植物の成長、および発達において主要な役割を果たしていることを示しています。私たちの調査結果は、代謝とエピジェネティックな調節の間の協調作用の直接的な証拠を提供します。"]
[18,30222730,"plant","Arabidopsis","CRISPR;","topoisomerase 3alpha (TOP3alpha)","PLoS genetics","The topoisomerase 3alpha zinc-finger domain T1 of Arabidopsis thaliana is required for targeting the enzyme activity to Holliday junction-like DNA repair intermediates.",2018,"14(9):e1007674","[Dorn A et al.]","Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany.",30222730,"10.1371/journal.pgen.1007674 ","Topoisomerase 3alpha, a class I topoisomerase, consists of a TOPRIM domain, an active centre and a variable number of zinc-finger domains (ZFDs) at the C-terminus, in multicellular organisms. Whereas the functions of the TOPRIM domain and the active centre are known, the specific role of the ZFDs is still obscure. In contrast to mammals where a knockout of TOP3alpha leads to lethality, we found that CRISPR/Cas induced mutants in Arabidopsis are viable but show growth retardation and meiotic defects, which can be reversed by the expression of the complete protein. However, complementation with AtTOP3alpha missing either the TOPRIM-domain or carrying a mutation of the catalytic tyrosine of the active  centre leads to embryo lethality. Surprisingly, this phenotype can be overcome by the simultaneous removal of the ZFDs from the protein. In combination with a mutation of the nuclease AtMUS81, the TOP3alpha knockout proved to be also embryo lethal. Here, expression of TOP3alpha without ZFDs, and in particular without the conserved ZFD T1, leads to only a partly complementation in root growth-in contrast to the complete protein, that restores root length to mus81-1 mutant level. Expressing the E. coli resolvase RusA in this background, which is able to process Holliday junction (HJ)-like recombination intermediates, we could rescue  this root growth defect. Considering all these results, we conclude that the ZFD  T1 is specifically required for targeting the topoisomerase activity to HJ like recombination intermediates to enable their processing. In the case of an inactivated enzyme, this leads to cell death due to the masking of these intermediates, hindering their resolution by MUS81.","Arabidopsis","クラスIトポイソメラーゼであるトポイソメラーゼ3alphaは、多細胞生物のC末端にあるTOPRIMドメイン、活性中心、および可変数のジンクフィンガードメイン（ZFD）で構成されています。TOPRIMドメインとアクティブセンターの機能はわかっていますが、ZFDの特定の役割はまだ不明です。TOP3alphaのノックアウトが致死につながる哺乳類とは対照的に、アラビドプシスのCRISPR / Cas誘導変異体は実行可能ですが、完全なタンパク質の発現によって逆転できる成長遅延と減数分裂障害を示すことがわかりました。ただし、TOPRIMドメインが欠落しているか、アクティブセンターの触媒チロシンの変異を持っているAtTOP3alphaによる補完は、胚の致死につながります。驚くべきことに、この表現型は、タンパク質からZFDを同時に除去することで克服できます。ヌクレアーゼAtMUS81の突然変異と組み合わせて、TOP3alphaノックアウトも胚致死性であることが証明されました。ここで、ZFDなし、特に保存されたZFD T1なしのTOP3alphaの発現は、根の長さをmus81-1変異体レベルに戻す完全なタンパク質とは対照的に、根の成長を部分的に補完するだけです。このバックグラウンドでE.coliレゾルバーゼRusAを発現させると、ホリデイジャンクション（HJ）のような組換え中間体を処理できるため、この根の成長の欠陥を救うことができます。これらすべての結果を考慮すると、ZFD T1は、トポイソメラーゼ活性を組換え中間体のようにHJにターゲティングして、それらの処理を可能にするために特に必要であると結論付けます。不活化酵素の場合、これはこれらの中間体のマスキングによる細胞死につながり、MUS81によるそれらの分解を妨げます。"]
[19,29444862,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","FLOWERING WAGENINGEN (FWA); CACTA1 transposon","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Targeted DNA demethylation of the Arabidopsis genome using the human TET1 catalytic domain.",2018,"115(9):E2125-E2134","[Gallego-Bartolome J et al.]","University of California, Los Angeles, CA, USA.",29444862,"10.1073/pnas.1716945115 ","DNA methylation is an important epigenetic modification involved in gene regulation and transposable element silencing. Changes in DNA methylation can be  heritable and, thus, can lead to the formation of stable epialleles. A well-characterized example of a stable epiallele in plants is fwa, which consists of the loss of DNA cytosine methylation (5mC) in the promoter of the FLOWERING WAGENINGEN (FWA) gene, causing up-regulation of FWA and a heritable late-flowering phenotype. Here we demonstrate that a fusion between the catalytic domain of the human demethylase TEN-ELEVEN TRANSLOCATION1 (TET1cd) and an artificial zinc finger (ZF) designed to target the FWA promoter can cause highly  efficient targeted demethylation, FWA up-regulation, and a heritable late-flowering phenotype. Additional ZF-TET1cd fusions designed to target methylated regions of the CACTA1 transposon also caused targeted demethylation and changes in expression. Finally, we have developed a CRISPR/dCas9-based targeted demethylation system using the TET1cd and a modified SunTag system. Similar to the ZF-TET1cd fusions, the SunTag-TET1cd system is able to target demethylation and activate gene expression when directed to the FWA or CACTA1 loci. Our study provides tools for targeted removal of 5mC at specific loci in the genome with high specificity and minimal off-target effects. These tools provide the opportunity to develop new epialleles for traits of interest, and to  reactivate expression of previously silenced genes, transgenes, or transposons.","Arabidopsis","DNAメチル化は、遺伝子調節と転移因子のサイレンシングに関与する重要なエピジェネティックな修飾です。DNAメチル化の変化は遺伝性である可能性があり、したがって、安定したエピアレルの形成につながる可能性があります。植物の安定したエピアレルのよく特徴付けられた例はfwaであり、これはFLOWERING WAGENINGEN（FWA）遺伝子のプロモーターにおけるDNAシトシンメチル化（5mC）の喪失から成り、FWAのアップレギュレーションと遺伝性の遅咲きを引き起こします。表現型。ここでは、ヒトデメチラーゼTEN-ELEVEN TRANSLOCATION1（TET1cd）の触媒ドメインとFWAプロモーターを標的とするように設計された人工ジンクフィンガー（ZF）との融合が、非常に効率的な標的脱メチル化、FWAアップレギュレーション、および遺伝性を引き起こす可能性があることを示します。遅咲きの表現型。CACTA1トランスポゾンのメチル化領域を標的とするように設計された追加のZF-TET1cd融合も、標的化された脱メチル化と発現の変化を引き起こしました。最後に、TET1cdと修正されたSunTagシステムを使用して、CRISPR / dCas9ベースのターゲット脱メチル化システムを開発しました。ZF-TET1cd融合と同様に、SunTag-TET1cdシステムは、FWAまたはCACTA1遺伝子座に向けられると、脱メチル化を標的とし、遺伝子発現を活性化することができます。私たちの研究は、ゲノム内の特定の遺伝子座で5mCをターゲットを絞って除去するためのツールを提供し、高い特異性と最小限のオフターゲット効果を提供します。これらのツールは、関心のある特性の新しいエピアレルを開発し、以前にサイレンシングされた遺伝子、トランスジーン、またはトランスポゾンの発現を再活性化する機会を提供します。"]
[20,30267262,"plant","Arabidopsis","Cas9;","4 genes including HAB1.1 (type 2C phosphatase) and RS31A","Science China. Life sciences","Manipulating mRNA splicing by base editing in plants.",2018,"61(11):1293-1300","[Xue C et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30267262,"10.1007/s11427-018-9392-7 ","Precursor-mRNAs (pre-mRNA) can be processed into one or more mature mRNA isoforms through constitutive or alternative splicing pathways. Constitutive splicing of pre-mRNA plays critical roles in gene expressional regulation, such as intron-mediated enhancement (IME), whereas alternative splicing (AS) dramatically increases the protein diversity and gene functional regulation. However, the unavailability of mutants for individual spliced isoforms in plants has been a major limitation in studying the function of mRNA splicing. Here, we describe an  efficient tool for manipulating the splicing of plant genes. Using a Cas9-directed base editor, we converted the 5' splice sites in four Arabidopsis genes from the activated GT form to the inactive AT form. Silencing the AS of HAB1.1 (encoding a type 2C phosphatase) validated its function in abscisic acid signaling, while perturbing the AS of RS31A revealed its functional involvement in plant response to genotoxic treatment for the first time. Lastly, altering the constitutive splicing of Act2 via base editing facilitated the analysis of IME. This strategy provides an efficient tool for investigating the function and regulation of gene splicing in plants and other eukaryotes.","Arabidopsis","前駆体mRNA（pre-mRNA）は、構成的または選択的スプライシング経路を介して1つまたは複数の成熟mRNAアイソフォームに処理できます。プレmRNAの構成的スプライシングは、イントロン媒介増強（IME）などの遺伝子発現調節において重要な役割を果たしますが、代替スプライシング（AS）は、タンパク質の多様性と遺伝子機能調節を劇的に増加させます。ただし、植物の個々のスプライシングアイソフォームの変異体が利用できないことは、mRNAスプライシングの機能を研究する上での主要な制限となっています。ここでは、植物遺伝子のスプライシングを操作するための効率的なツールについて説明します。Cas9向けのベースエディターを使用して、4つのシロイヌナズナ遺伝子の5 'スプライス部位を活性化GT型から非活性型AT型に変換しました。HAB1.1（2Cホスファターゼをコードする）のASをサイレンシングすることで、アブシジン酸シグナル伝達におけるその機能が検証され、RS31AのASを混乱させることで、遺伝毒性処理に対する植物の応答への機能的関与が初めて明らかになりました。最後に、塩基編集を介してAct2の構成的スプライシングを変更すると、IMEの分析が容易になりました。この戦略は、植物や他の真核生物における遺伝子スプライシングの機能と調節を調査するための効率的なツールを提供します。"]
[21,29535386,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","Scientific reports","Highly efficient heritable targeted deletions of gene clusters and non-coding regulatory regions in Arabidopsis using CRISPR/Cas9.",2018,"8(1):4443","[Durr J et al.]","University of Warwick, Coventry, UK.",29535386,"10.1038/s41598-018-22667-1 ","Genome editing using CRISPR/Cas9 is considered the best instrument for genome engineering in plants. This methodology is based on the nuclease activity of Cas9 that is guided to specific genome sequences by single guide RNAs (sgRNAs) thus enabling researchers to engineer simple mutations or large chromosomal deletions. Current methodologies for targeted genome editing in plants using CRISPR/Cas9 are however largely inefficient, mostly due to low Cas9 activity, variable sgRNA efficiency and low heritability of genetic lesions. Here, we describe a newly developed strategy to enhance CRISPR/Cas9 efficiency in Arabidopsis thaliana focusing on the design of novel binary vectors (pUbiCAS9-Red and pEciCAS9-Red), the selection of highly efficient sgRNAs, and the use of direct plant regeneration from induced cell cultures. Our work demonstrates that by combining  these three independent developments, heritable targeted chromosomal deletions of large gene clusters and intergenic regulatory sequences can be engineered at a high efficiency. Our results demonstrate that this improved CRISPR/Cas9 methodology can provide a fast, efficient and cost-effective tool to engineer targeted heritable chromosomal deletions, which will be instrumental for future high-throughput functional genomics studies in plants.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9を使用したゲノム編集は、植物のゲノム工学に最適な手段と考えられています。この方法論は、シングルガイドRNA（sgRNA）によって特定のゲノム配列に誘導されるCas9のヌクレアーゼ活性に基づいているため、研究者は単純な突然変異や大きな染色体欠失を操作することができます。ただし、CRISPR / Cas9を使用した植物でのターゲットゲノム編集の現在の方法論は、Cas9の活性が低く、sgRNAの効率が変動し、遺伝的病変の遺伝性が低いため、ほとんど非効率的です。ここでは、新規バイナリベクター（pUbiCAS9-RedおよびpEciCAS9-Red）の設計、非常に効率的なsgRNAの選択、およびからの直接植物再生の使用に焦点を当てて、シロイヌナズナのCRISPR / Cas9効率を高めるために新しく開発された戦略について説明します。誘導された細胞培養。私たちの仕事は、これら3つの独立した開発を組み合わせることにより、大きな遺伝子クラスターと遺伝子間調節配列の遺伝性の標的染色体欠失を高効率で操作できることを示しています。私たちの結果は、この改善されたCRISPR / Cas9方法論が、植物における将来のハイスループット機能ゲノミクス研究に役立つ、標的となる遺伝性染色体欠失を設計するための高速で効率的かつ費用効果の高いツールを提供できることを示しています。"]
[22,29392632,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","glutamate:glyoxylate aminotransferase 1 (ggat1 (Ler background))","Transgenic research","Arabidopsis glutamate:glyoxylate aminotransferase 1 (Ler) mutants generated by CRISPR/Cas9 and their characteristics.",2018,"27(1):61-74","[Liang Y et al.]","South-China Agricultural University, Guangzhou, China.",29392632,"10.1007/s11248-017-0052-z ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) technology provides an efficient tool  for editing the genomes of plants, animals and microorganisms. Glutamate:glyoxylate aminotransferase 1 (GGAT1) is a key enzyme in the photorespiration pathway; however, its regulation mechanism is largely unknown. Given that EMS-mutagenized ggat1 (Col-0 background) M2 pools have been generated, ggat1 (Ler background) should be very useful in the positional cloning of suppressor and/or enhancer genes of GGAT1. Unfortunately, such ggat1 (Ler) mutants are not currently available. In this study, CRISPR/Cas9 was used to generate ggat1 (Ler) mutants. Two GGAT1 target single-guide RNAs (sgRNAs) were constructed into pYLCRISPR/Cas9P35S-N, and flowering Arabidopsis (Ler) plants were transformed using an Agrobacterium tumefaciens-mediated floral dip protocol. Eleven chimeric and two heterozygous GGAT1-edited T1 lines of target 1 were separately screened from positive transgenic lines. Two ggat1 homozygous mutants, CTC-deletion and T-deletion at target 1, were generated from T2 generations of the 13 T1 lines. The edited mutation sites were found to be stable through generations regardless of whether the T-DNA was present. In addition, the genetic segregation of the mutation sites obeyed the Mendelian single gene segregation rule, and no mutations were detected at the possible off-target site. Also, the two independent ggat1 mutants had similar photorespiration phenotypes and down-regulated GGAT enzyme activity. Together, these results indicate that genetically stable ggat1 (Ler) mutants were generated by CRISPR/Cas9 genome editing, and these mutants will be used to promote the positional cloning of suppressor and/or enhancer genes of GGAT1 in our subsequent study.","Arabidopsis","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（CRISPR / Cas9）テクノロジーは、植物、動物、微生物のゲノムを編集するための効率的なツールを提供します。グルタメート：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ1（GGAT1）は、光呼吸経路の重要な酵素です。ただし、その規制メカニズムはほとんど知られていません。EMSで変異誘発されたggat1（Col-0バックグラウンド）M2プールが生成されていることを考えると、ggat1（Lerバックグラウンド）は、GGAT1のサプレッサーおよび/またはエンハンサー遺伝子のポジショナルクローニングに非常に役立つはずです。残念ながら、そのようなggat1（Ler）変異体は現在利用できません。この研究では、CRISPR / Cas9を使用してggat1（Ler）変異体を生成しました。2つのGGAT1ターゲットシングルガイドRNA（sgRNA）がpYLCRISPR / Cas9P35S-Nに構築され、開花シロイヌナズナ（Ler）植物がアグロバクテリウムツメファシエンスを介したフローラルディッププロトコルを使用して形質転換されました。ターゲット1の11のキメラおよび2つのヘテロ接合GGAT1編集T1系統は、陽性トランスジェニック系統から別々にスクリーニングされました。2つのggat1ホモ接合変異体、ターゲット1でのCTC削除とT削除は、13のT1系統のT2世代から生成されました。編集された突然変異部位は、T-DNAが存在するかどうかに関係なく、世代を通じて安定していることがわかりました。さらに、突然変異部位の遺伝的分離はメンデルの単一遺伝子分離規則に従い、可能性のあるオフターゲット部位で突然変異は検出されませんでした。また、2つの独立したggat1変異体は、同様の光呼吸表現型とダウンレギュレートされたGGAT酵素活性を持っていました。総合すると、これらの結果は、遺伝的に安定したggat1（Ler）変異体がCRISPR / Cas9ゲノム編集によって生成されたことを示しており、これらの変異体は、今後の研究でGGAT1のサプレッサーおよび/またはエンハンサー遺伝子のポジショナルクローニングを促進するために使用されます。"]
[23,29714687,"plant","Arabidopsis thaliana","Cas9;","synthetic and modular hormone activated Cas9-based repressors that respond to auxin, gibberellins, jasmonates","eLife","Synthetic hormone-responsive transcription factors can monitor and re-program plant development.",2018,"7","[Khakhar A  et al.]","University of Washington, Seattle, WA, USA.",29714687,"10.7554/eLife.34702 ","Developmental programs sculpt plant morphology to meet environmental challenges,  and these same programs have been manipulated to increase agricultural productivity (Doebley et al., 1997; Khush, 2001). Hormones coordinate these programs, creating chemical circuitry (Vanstraelen and Benkova, 2012) that has been represented in mathematical models (Refahi et al., 2016; Prusinkiewicz et al., 2009); however, model-guided engineering of plant morphology has been limited by a lack of tools (Parry et al., 2009; Voytas and Gao, 2014). Here, we introduce a novel set of synthetic and modular hormone activated Cas9-based repressors (HACRs) in Arabidopsis thaliana that respond to three hormones: auxin, gibberellins and jasmonates. We demonstrate that HACRs are sensitive to both exogenous hormone treatments and local differences in endogenous hormone levels associated with development. We further show that this capability can be leveraged to reprogram development in an agriculturally relevant manner by changing how the hormonal circuitry regulates target genes. By deploying a HACR to re-parameterize the auxin-induced expression of the auxin transporter PIN-FORMED1 (PIN1), we decreased shoot branching and phyllotactic noise, as predicted by existing models (Refahi et al., 2016; Prusinkiewicz et al., 2009).","Arabidopsis","開発プログラムは、環境の課題に対応するために植物の形態を形作り、これらの同じプログラムは、農業の生産性を高めるために操作されてきました（Doebley et al。、1997; Khush、2001）。ホルモンはこれらのプログラムを調整し、数学モデル（Refahi et al。、2016; Prusinkiewicz et al。、2009）で表される化学回路（Vanstraelen and Benkova、2012）を作成します。ただし、植物形態のモデルに基づくエンジニアリングは、ツールの不足によって制限されてきました（Parry et al。、2009; Voytas and Gao、2014）。ここでは、オーキシン、ジベレリン、ジャスモン酸の3つのホルモンに反応する、シロイヌナズナの合成およびモジュラーホルモン活性化Cas9ベースのリプレッサー（HACR）の新しいセットを紹介します。HACRは、外因性ホルモン治療と、発生に関連する内因性ホルモンレベルの局所的な違いの両方に敏感であることを示しています。さらに、ホルモン回路が標的遺伝子を調節する方法を変更することにより、この機能を利用して、農業に関連する方法で開発を再プログラムできることを示します。HACRを展開して、オーキシントランスポーターPIN-FORMED1（PIN1）のオーキシン誘導発現を再パラメーター化することにより、既存のモデルで予測されるように、シュートの分岐とフィロタクティックノイズを低減しました（Refahi et al。、2016; Prusinkiewicz et al。、 2009）。"]
[24,30459790,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","nonsense mediated RNA decay factor SMG7","Frontiers in plant science","Functional Characterization of SMG7 Paralogs in Arabidopsis thaliana.",2018,"9:1602","[Capitao C et al.]","Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology, Austrian Academy of Sciences, Vienna, Austria.",30459790,"10.3389/fpls.2018.01602 ","SMG7 proteins are evolutionary conserved across eukaryotes and primarily known for their function in nonsense mediated RNA decay (NMD). In contrast to other NMD factors, SMG7 proteins underwent independent expansions during evolution indicating their propensity to adopt novel functions. Here we characterized SMG7  and SMG7-like (SMG7L) paralogs in Arabidopsis thaliana. SMG7 retained its role in NMD and additionally appears to have acquired another function in meiosis. We inactivated SMG7 by CRISPR/Cas9 mutagenesis and showed that, in contrast to our previous report, SMG7 is not an essential gene in Arabidopsis. Furthermore, our data indicate that the N-terminal phosphoserine-binding domain is required for both NMD and meiosis. Phenotypic analysis of SMG7 and SMG7L double mutants did not indicate any functional redundancy between the two genes, suggesting neofunctionalization of SMG7L. Finally, protein sequence comparison together with a phenotyping of T-DNA insertion mutants identified several conserved regions specific for SMG7 that may underlie its role in NMD and meiosis. This information provides a framework for deciphering the non-canonical functions of SMG7-family proteins.","Arabidopsis","SMG7タンパク質は真核生物全体で進化的に保存されており、ナンセンス変異依存RNA崩壊（NMD）における機能で主に知られています。他のNMD因子とは対照的に、SMG7タンパク質は進化中に独立した拡張を受け、新しい機能を採用する傾向を示しています。ここでは、ArabidopsisthalianaのSMG7およびSMG7のような（SMG7L）パラログを特徴づけました。SMG7はNMDでの役割を維持し、さらに減数分裂で別の機能を獲得したようです。CRISPR / Cas9変異誘発によってSMG7を不活性化し、以前の報告とは対照的に、SMG7はアラビドプシスの必須遺伝子ではないことを示しました。さらに、私たちのデータは、N末端ホスホセリン結合ドメインがNMDと減数分裂の両方に必要であることを示しています。SMG7およびSMG7L二重変異体の表現型分析は、2つの遺伝子間の機能的冗長性を示さず、SMG7Lの新機能化を示唆している。最後に、タンパク質配列の比較とT-DNA挿入変異体の表現型の比較により、NMDと減数分裂におけるその役割の根底にある可能性のあるSMG7に特異的ないくつかの保存領域が特定されました。この情報は、SMG7ファミリータンパク質の非標準的な機能を解読するためのフレームワークを提供します。"]
[25,29884615,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","several different genes","G3","A Dual sgRNA Approach for Functional Genomics in Arabidopsis thaliana.",2018,"8(8):2603-2615","[Pauwels L  et al.]","Ghent University, Ghent, Belgium.",29884615,"10.1534/g3.118.200046 ","Reverse genetics uses loss-of-function alleles to interrogate gene function. The  advent of CRISPR/Cas9-based gene editing now allows the generation of knock-out alleles for any gene and entire gene families. Even in the model plant Arabidopsis thaliana, gene editing is welcomed as T-DNA insertion lines do not always generate null alleles. Here, we show efficient generation of heritable mutations in Arabidopsis using CRISPR/Cas9 with a workload similar to generating  overexpression lines. We obtain for several different genes Cas9 null-segregants  with bi-allelic mutations in the T2 generation. While somatic mutations were predominantly generated by the canonical non-homologous end joining (cNHEJ) pathway, we observed inherited mutations that were the result of synthesis-dependent microhomology-mediated end joining (SD-MMEJ), a repair pathway linked to polymerase theta (PolQ). We also demonstrate that our workflow  is compatible with a dual sgRNA approach in which a gene is targeted by two sgRNAs simultaneously. This paired nuclease method results in more reliable loss-of-function alleles that lack a large essential part of the gene. The ease of the CRISPR/Cas9 workflow should help in the eventual generation of true null alleles of every gene in the Arabidopsis genome, which will advance both basic and applied plant research.","Arabidopsis","逆遺伝学は、機能喪失型対立遺伝子を使用して遺伝子機能を調べます。CRISPR / Cas9ベースの遺伝子編集の出現により、任意の遺伝子および遺伝子ファミリー全体のノックアウト対立遺伝子の生成が可能になりました。モデル植物のシロイヌナズナでも、T-DNA挿入ラインが常にヌル対立遺伝子を生成するとは限らないため、遺伝子編集は歓迎されます。ここでは、過剰発現ラインの生成と同様のワークロードでCRISPR / Cas9を使用して、シロイヌナズナで遺伝性突然変異を効率的に生成する方法を示します。いくつかの異なる遺伝子について、T2世代に2対立遺伝子変異を持つCas9ヌル分離体を取得します。体細胞変異は主に標準的な非相同末端結合（cNHEJ）経路によって生成されましたが、ポリメラーゼシータにリンクされた修復経路である合成依存性ミクロホモロジー媒介末端結合（SD-MMEJ）の結果である遺伝性変異を観察しました（ PolQ）。また、ワークフローが、遺伝子が2つのsgRNAによって同時にターゲットとなるデュアルsgRNAアプローチと互換性があることも示しています。このペアヌクレアーゼ法は、遺伝子の大部分を欠く、より信頼性の高い機能喪失型対立遺伝子をもたらします。CRISPR / Cas9ワークフローの容易さは、アラビドプシスゲノム内のすべての遺伝子の真のヌル対立遺伝子の最終的な生成に役立つはずです。これにより、基本的な植物研究と応用植物研究の両方が進歩します。"]
[26,29720392,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","Adaptor Protein Complex 2 (AP2) mu-adaptin gene (AP2M)","G3","Activation of Self-Incompatibility Signaling in Transgenic Arabidopsis thaliana Is Independent of AP2-Based Clathrin-Mediated Endocytosis.",2018,"8(7):2231-2239","[Yamamoto M et al.]","Tohoku University, Sendai, Miyagi, Japan.",29720392,"10.1534/g3.118.200231 ","Internalization of plasma membrane (PM)-localized ligand-activated receptor kinases and their trafficking to sorting endosomes have traditionally been viewed as functioning primarily in the down-regulation of receptor signaling, but are now considered to be also essential for signaling by some receptors. A major mechanism for internalization of PM proteins is clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is mediated by the Adaptor Protein Complex 2 (AP2), which is involved  in interaction of the AP2 mu-adaptin subunit with a tyrosine-based Yxxvarphi motif located in the cytoplasmic domain of the cargo protein. In this study, we investigated the role of AP2-mediated CME for signaling by the S-locus receptor kinase (SRK), a protein localized in the PM of stigma epidermal cells, which, together with its pollen coat-localized S-locus cysteine-rich (SCR) ligand, functions in the self-incompatibility (SI) response of the Brassicaceae. Using Arabidopsis thaliana plants that were made self-incompatible by transformation with an A. lyrata-derived SRK/SCR gene pair, we tested the effect on SI of site-directed mutations in each of the two Yxxvarphi motifs in SRK and of a CRISPR/Cas9-induced null mutation in the AP2 mu-adaptin gene AP2M Both in vitro SRK kinase activity and the in planta SI response were abolished by substitution  of tyrosine in one of the two Yxxvarphi motifs, but were unaffected by elimination of either the second Yxxvarphi motif or AP2M function. Thus, AP2-mediated CME is considered to be unnecessary for SRK signaling in the SI response.","Arabidopsis","原形質膜（PM）に局在するリガンド活性化受容体キナーゼの内在化およびそれらの選別エンドソームへの輸送は、伝統的に主に受容体シグナル伝達のダウンレギュレーションで機能すると見なされてきたが、現在、いくつかの受容体によるシグナル伝達にも不可欠であると考えられている。PMタンパク質の内在化の主なメカニズムは、クラスリンを介したエンドサイトーシス（CME）です。CMEは、AP2mu-adaptinサブユニットとカーゴタンパク質の細胞質ドメインにあるチロシンベースのYxxvarphiモチーフとの相互作用に関与するAdapterProtein Complex 2（AP2）によって媒介されます。この研究では、柱頭表皮細胞のPMに局在するタンパク質であるS遺伝子座受容体キナーゼ（SRK）によるシグナル伝達に対するAP2媒介CMEの役割を調査しました。これは、花粉コートに局在するS遺伝子座システインとともに-リッチ（SCR）リガンドは、Brassicaceaeの自己不適合（SI）応答で機能します。A.lyrata由来のSRK / SCR遺伝子ペアによる形質転換によって自己不適合にされたArabidopsisthaliana植物を使用して、SRKの2つのYxxvarphiモチーフのそれぞれにおける部位特異的変異およびCRISPR /のSIへの影響をテストしました。 AP2 mu-adaptin遺伝子AP2MにおけるCas9誘導ヌル変異2つのYxxvarphiモチーフの1つでチロシンを置換することにより、in vitroSRKキナーゼ活性と植物内SI応答の両方が無効になりましたが、2番目のYxxvarphiモチーフのいずれかを除去しても影響を受けませんでした。またはAP2M機能。したがって、AP2を介したCMEは、SI応答のSRKシグナリングには不要であると見なされます。"]
[27,30120167,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","stp4-6-8-9-10-11; HEXOKINASE1 (HXK1)","Plant cell","Glucose Uptake via STP Transporters Inhibits in Vitro Pollen Tube Growth in a HEXOKINASE1-Dependent Manner in Arabidopsis thaliana.",2018,"30(9):2057-2081","[Rottmann T  et al.]","Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Germany.",30120167,"10.1105/tpc.18.00356 ","Pollen tube growth requires a high amount of metabolic energy and precise targeting toward the ovules. Sugars, especially glucose, can serve as nutrients and as signaling molecules. Unexpectedly, in vitro assays revealed an inhibitory  effect of glucose on pollen tube elongation, contradicting the hypothesis that monosaccharide uptake is a source of nutrition for growing pollen tubes. Measurements with Forster resonance energy transfer-based nanosensors revealed that glucose is taken up into pollen tubes and that the intracellular concentration is in the low micromolar range. Pollen tubes of stp4-6-8-9-10-11 sextuple knockout plants generated by crossings and CRISPR/Cas9 showed only a weak response to glucose, indicating that glucose uptake into pollen tubes is mediated mainly by these six monosaccharide transporters of the SUGAR TRANSPORT PROTEIN (STP) family. Analyses of HEXOKINASE1 (HXK1) showed a strong expression of this gene in pollen. Together with the glucose insensitivity and altered semi-in vivo growth rate of pollen tubes from hxk1 knockout lines, this strongly  suggests that glucose is an important signaling molecule for pollen tubes, is taken up by STPs, and detected by HXK1. Equimolar amounts of fructose abolish the inhibitory effect of glucose indicating that only an excess of glucose is interpreted as a signal. This provides a possible model for the discrimination of signaling and nutritional sugars.","Arabidopsis","花粉管の成長には、大量の代謝エネルギーと胚珠への正確なターゲティングが必要です。糖、特にブドウ糖は、栄養素およびシグナル伝達分子として機能します。予期せぬことに、インビトロアッセイは、花粉管の伸長に対するグルコースの阻害効果を明らかにし、単糖の取り込みが花粉管を成長させるための栄養源であるという仮説と矛盾している。Forster共鳴エネルギー伝達ベースのナノセンサーを用いた測定により、グルコースが花粉管に取り込まれ、細胞内濃度が低マイクロモル範囲にあることが明らかになりました。交配とCRISPR / Cas9によって生成されたstp4-6-8-9-10-11六重ノックアウト植物の花粉管は、グルコースに対して弱い応答しか示さず、花粉管へのグルコース取り込みは、主にSUGARのこれら6つの単糖トランスポーターによって媒介されることを示しています輸送タンパク質（STP）ファミリー。HEXOKINASE1（HXK1）の分析は、花粉におけるこの遺伝子の強い発現を示しました。これは、hxk1ノックアウトラインからの花粉管のグルコース非感受性および変化したセミインビボ成長速度とともに、グルコースが花粉管の重要なシグナル伝達分子であり、STPによって取り込まれ、HXK1によって検出されることを強く示唆している。等モル量のフルクトースは、グルコースの阻害効果を無効にし、過剰なグルコースのみがシグナルとして解釈されることを示しています。これは、シグナル伝達糖と栄養糖を区別するための可能なモデルを提供します。"]
[28,29356153,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;TALENs;","MUN (MERISTEM UNSTRUCTURED)","Plant journal","MUN (MERISTEM UNSTRUCTURED), encoding a SPC24 homolog of NDC80 kinetochore complex, affects development through cell division in Arabidopsis thaliana.",2018,"93(6):977-991","[Shin J  et al.]","Seoul National University, Seoul, Korea.",29356153,"10.1111/tpj.13823 ","Kinetochore, a protein super-complex on the centromere of chromosomes, mediates chromosome segregation during cell division by providing attachment sites for spindle microtubules. The NDC80 complex, composed of four proteins, NDC80, NUF2,  SPC24 and SPC25, is localized at the outer kinetochore and connects spindle fibers to the kinetochore. Although it is conserved across species, functional studies of this complex are rare in Arabidopsis. Here, we characterize a recessive mutant, meristem unstructured-1 (mun-1), exhibiting an abnormal phenotype with unstructured shoot apical meristem caused by ectopic expression of the WUSCHEL gene in unexpected tissues. mun-1 is a weak allele because of the insertion of T-DNA in the promoter region of the SPC24 homolog. The mutant exhibits stunted growth, embryo arrest, DNA aneuploidy, and defects in chromosome segregation with a low cell division rate. Null mutants of MUN from TALEN and CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis showed zygotic embryonic lethality similar to nuf2-1; however, the null mutations were fully transmissible via pollen and ovules. Interactions among the components of the NDC80 complex were confirmed in  a yeast two-hybrid assay and in planta co-immunoprecipitation. MUN is co-localized at the centromere with HTR12/CENH3, which is a centromere-specific histone variant, but MUN is not required to recruit HTR12/CENH3 to the kinetochore. Our results support that MUN is a functional homolog of SPC24 in Arabidopsis, which is required for proper cell division. In addition, we report the ectopic generations of stem cell niches by the malfunction of kinetochore components.","Arabidopsis","染色体のセントロメア上のタンパク質超複合体である動原体は、紡錘体微小管の付着部位を提供することにより、細胞分裂中の染色体分離を仲介します。NDC80、NUF2、SPC24、SPC25の4つのタンパク質で構成されるNDC80複合体は、外側の動原体に局在し、紡錘体繊維を動原体に接続します。種間で保存されていますが、この複合体の機能研究はシロイヌナズナではまれです。ここでは、予期しない組織でのWUSCHEL遺伝子の異所性発現によって引き起こされる、構造化されていない茎頂メリステムを伴う異常な表現型を示す劣性変異体、メリステム非構造化-1（mun-1）を特徴づけます。mun-1は、SPC24ホモログのプロモーター領域にT-DNAが挿入されているため、弱い対立遺伝子です。変異体は、発育阻害、胚停止、DNA異数性、および低い細胞分裂率での染色体分離の欠陥を示します。TALENおよびCRISPR / Cas9を介した突然変異誘発からのMUNのヌル変異体は、nuf2-1と同様の接合胚致死性を示しました。しかし、ヌル突然変異は花粉と胚珠を介して完全に伝染しました。NDC80複合体の成分間の相互作用は、酵母ツーハイブリッドアッセイおよび植物の共免疫沈降で確認されました。MUNは、セントロメアに特異的なヒストンバリアントであるHTR12 / CENH3と共局在していますが、MUNはHTR12 / CENH3を動原体に動員する必要はありません。私たちの結果は、MUNがシロイヌナズナのSPC24の機能的相同体であり、適切な細胞分裂に必要であることを裏付けています。さらに、キネトコア成分の機能不全による幹細胞ニッチの異所性世代を報告します。"]
[29,30083222,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","nucleotide binding site leucine-rich repeat genes","Plant methods","An efficient CRISPR vector toolbox for engineering large deletions in Arabidopsis thaliana.",2018,"14:65","[Wu R  et al.]","Max Planck Institute for Developmental Biology, Tubingen, Germany.",30083222,"10.1186/s13007-018-0330-7 ","Background: Our knowledge of natural genetic variation is increasing at an extremely rapid pace, affording an opportunity to come to a much richer understanding of how effects of specific genes are dependent on the genetic background. To achieve a systematic understanding of such GxG interactions, it is desirable to develop genome editing tools that can be rapidly deployed across many different genetic varieties. Results: We present an efficient CRISPR/Cas9 toolbox of super module (SM) vectors. These vectors are based on a previously described fluorescence protein marker expressed in seeds allowing identification  of transgene-free mutants. We have used this vector series to delete genomic regions ranging from 1.7 to 13 kb in different natural accessions of the wild plant Arabidopsis thaliana. Based on results from 53 pairs of sgRNAs targeting individual nucleotide binding site leucine-rich repeat (NLR) genes, we provide a  comprehensive overview of obtaining heritable deletions. Conclusions: The SM series of CRISPR/Cas9 vectors enables the rapid generation of transgene-free, genome edited plants for a diversity of functional studies.","Arabidopsis","背景：自然の遺伝的変異に関する知識は非常に急速に増加しており、特定の遺伝子の影響が遺伝的背景にどのように依存しているかをより深く理解する機会を与えています。このようなGxG相互作用を体系的に理解するには、多くの異なる遺伝的品種に迅速に展開できるゲノム編集ツールを開発することが望まれます。結果：スーパーモジュール（SM）ベクターの効率的なCRISPR / Cas9ツールボックスを紹介します。これらのベクターは、種子で発現された前述の蛍光タンパク質マーカーに基づいており、導入遺伝子を含まない変異体の同定を可能にします。このベクターシリーズを使用して、野生植物Arabidopsisthalianaのさまざまな自然系統の1.7〜13kbの範囲のゲノム領域を削除しました。個々のヌクレオチド結合部位であるロイシンリッチリピート（NLR）遺伝子を標的とする53ペアのsgRNAの結果に基づいて、遺伝性欠失の取得に関する包括的な概要を提供します。結論：CRISPR / Cas9ベクターのSMシリーズは、多様な機能研究のために、遺伝子導入のない、ゲノム編集された植物の迅速な生成を可能にします。"]
[30,30301773,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;","20-kD endonuclease (atm20)","Plant physiology","The Mitochondrial Endonuclease M20 Participates in the Down-Regulation of Mitochondrial DNA in Pollen Cells.",2018,"178(4):1537-1550","[Ma F et al.]","Peking University, Beijing, China.",30301773,"10.1104/pp.18.00754 ","Maintaining the appropriate number of mitochondrial DNA (mtDNA) molecules is crucial for supporting mitochondrial metabolism and function in both plant and animal cells. For example, a substantial decrease in mtDNA levels occurs as a key part of pollen development. The molecular mechanisms regulating mtDNA copy number are largely unclear, particularly with regard to those that reduce mtDNA levels.  Here, we identified and purified a , M20, from maize (Zea mays) pollen mitochondria. We found M20 to be an His-Asn-His/Asn (H-N-H/N) nuclease that degrades linear and circular DNA in the presence of Mg(2+) or Mn(2+) Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) AtM20, which shared high sequence similarity with maize M20, localized to the mitochondria, had a similar H-N-H/N structure, and degraded both linear and circular DNA. AtM20 transcript levels increased during pollen development, in parallel with a rapid reduction in mtDNA. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 genome-editing techniques were used to generate knockout lines of AtM20 (atm20), which exhibited a significant delay in the reduction in mtDNA levels in  pollen vegetative cells but normal mtDNA levels in somatic cells. The delayed reduction in pollen mtDNA levels was rescued by the transgenic expression of AtM20 in atm20 plants. This study thus uncovers an endonucleolytic DNase in plant mitochondria and its crucial role in reducing mtDNA levels, pointing to the complex mechanism regulating mtDNA levels in plants.","Arabidopsis","適切な数のミトコンドリアDNA（mtDNA）分子を維持することは、植物細胞と動物細胞の両方でミトコンドリアの代謝と機能をサポートするために重要です。たとえば、mtDNAレベルの大幅な低下は、花粉の発達の重要な部分として発生します。mtDNAのコピー数を調節する分子メカニズムは、特にmtDNAレベルを低下させるメカニズムに関してはほとんど不明です。ここでは、トウモロコシ（Zea mays）の花粉ミトコンドリアからM20を同定して精製しました。M20はHis-Asn-His / Asn（HNH / N）ヌクレアーゼであり、Mg（2+）またはMn（2+）シロイヌナズナ（Arabidopsisthaliana）AtM20の存在下で線状および環状DNAを分解します。ミトコンドリアに局在するトウモロコシM20との配列類似性は、同様のHNH / N構造を持ち、線状DNAと環状DNAの両方を分解しました。AtM20転写レベルは、mtDNAの急速な減少と並行して、花粉の発達中に増加しました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9ゲノム編集技術を使用してAtM20（atm20）のノックアウトラインを生成しました。これは、花粉栄養細胞のmtDNAレベルの低下を大幅に遅らせましたが、mtDNAレベルは正常でした。体細胞で。花粉mtDNAレベルの遅延した減少は、atm20植物におけるAtM20のトランスジェニック発現によって救われました。したがって、この研究は、植物ミトコンドリアのエンドヌクレアーゼDNaseと、mtDNAレベルの低下におけるその重要な役割を明らかにし、植物のmtDNAレベルを調節する複雑なメカニズムを示しています。"]
[31,30572690,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;","helper component proteinase silencing suppressor (HC-Pro); GFP target 2 (GFP-T2)","Viruses","Engineering RNA Virus Interference via the CRISPR/Cas13 Machinery in Arabidopsis.",2018,"10(12)","[Aman R et al.]","King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia.",30572690,"10.3390/v10120732 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems are key immune mechanisms helping prokaryotic species fend off RNA and DNA viruses. CRISPR/Cas9 has broad applications in basic research and biotechnology and has been widely used across eukaryotic species for genome engineering and functional analysis of genes. The recently developed CRISPR/Cas13 systems target RNA rather than DNA and thus offer new potential for  transcriptome engineering and combatting RNA viruses. Here, we used CRISPR/LshCas13a to stably engineer Arabidopsis thaliana for interference against the RNA genome of Turnip mosaic virus (TuMV). Our data demonstrate that CRISPR RNAs (crRNAs) guiding Cas13a to the sequences encoding helper component proteinase silencing suppressor (HC-Pro) or GFP target 2 (GFP-T2) provide better  interference compared to crRNAs targeting other regions of the TuMV RNA genome. This work demonstrates the exciting potential of CRISPR/Cas13 to be used as an antiviral strategy to obstruct RNA viruses, and encourages the search for more robust and effective Cas13 variants or CRISPR systems that can target RNA.","Arabidopsis","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）およびCRISPR関連（Cas）システムは、原核生物種がRNAおよびDNAウイルスをかわすのに役立つ重要な免疫メカニズムです。CRISPR / Cas9は、基礎研究とバイオテクノロジーに幅広い用途があり、ゲノム工学と遺伝子の機能分析のために真核生物の種全体で広く使用されています。最近開発されたCRISPR / Cas13システムは、DNAではなくRNAを標的としているため、トランスクリプトームエンジニアリングとRNAウイルスとの戦いに新たな可能性をもたらします。ここでは、CRISPR / LshCas13aを使用して、Turnipモザイクウイルス（TuMV）のRNAゲノムに対する干渉のためにシロイヌナズナを安定的に操作しました。私たちのデータは、Cas13aをヘルパーコンポーネントプロテイナーゼサイレンシングサプレッサー（HC-Pro）またはGFPターゲット2（GFP-T2）をコードする配列に導くCRISPR RNA（crRNA）が、TuMVRNAゲノムの他の領域をターゲットとするcrRNAと比較してより良い干渉を提供することを示しています。この作業は、RNAウイルスを阻止するための抗ウイルス戦略として使用されるCRISPR / Cas13のエキサイティングな可能性を示し、RNAをターゲットにできるより堅牢で効果的なCas13バリアントまたはCRISPRシステムの検索を促進します。"]
[32,29161464,"plant","Arabidopsis; citrus plants","CRISPR;Cas9;"," ","Plant journal","Increased efficiency of targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in plants using heat  stress.",2018,"93(2):377-386","[LeBlanc C et al.]","Yale University, New Haven, CT, USA.",29161464,"10.1111/tpj.13782 ","The CRISPR/Cas9 system has greatly improved our ability to engineer targeted mutations in eukaryotic genomes. While CRISPR/Cas9 appears to work universally, the efficiency of targeted mutagenesis and the adverse generation of off-target mutations vary greatly between different organisms. In this study, we report that Arabidopsis plants subjected to heat stress at 37 degrees C show much higher frequencies of CRISPR-induced mutations compared to plants grown continuously at  the standard temperature (22 degrees C). Using quantitative assays relying on green fluorescent protein (GFP) reporter genes, we found that targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis is increased by approximately 5-fold in somatic tissues and up to 100-fold in the germline upon heat treatment. This effect of temperature on the mutation rate is not limited to Arabidopsis, as we observed a similar increase in targeted mutations by CRISPR/Cas9 in Citrus plants exposed to heat stress at 37 degrees C. In vitro assays demonstrate that Cas9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) is more active in creating double-stranded DNA breaks at 37 degrees C than at 22 degrees C, thus indicating a potential contributing mechanism for the in vivo effect of temperature on CRISPR/Cas9. This study reveals the importance of temperature in modulating SpCas9 activity in eukaryotes, and provides a simple method to increase on-target mutagenesis in plants using CRISPR/Cas9.","arabidopsis; citrus plants","CRISPR / Cas9システムは、真核生物のゲノムにおける標的変異を操作する能力を大幅に向上させました。CRISPR / Cas9は普遍的に機能しているように見えますが、標的変異誘発の効率と標的外変異の有害な生成は、生物によって大きく異なります。この研究では、37℃の熱ストレスにさらされたアラビドプシス植物が、標準温度（22℃）で継続的に成長した植物と比較して、CRISPRによって誘発される変異の頻度がはるかに高いことを報告します。緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子に依存する定量的アッセイを使用して、シロイヌナズナのCRISPR / Cas9による標的変異誘発は、体細胞組織で約5倍、生殖細胞系で最大100倍増加することがわかりました。37℃の熱ストレスにさらされた柑橘類植物でCRISPR / Cas9による標的突然変異の同様の増加が観察されたため、突然変異率に対するこの温度の影響はアラビドプシスに限定されません。invitroアッセイはStreptococcus pyogenes（SpCas9 ）は、22℃よりも37℃で二本鎖DNA切断を生成するのにより活発であり、したがって、CRISPR / Cas9に対する温度のinvivo効果の潜在的な寄与メカニズムを示しています。この研究は、真核生物のSpCas9活性の調節における温度の重要性を明らかにし、CRISPR / Cas9を使用して植物の標的変異誘発を増加させる簡単な方法を提供します。"]
[33,30442181,"plant","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;"," ","Genome biology","Conferring DNA virus resistance with high specificity in plants using virus-inducible genome-editing system.",2018,"19(1):197","[Ji X et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30442181,"10.1186/s13059-018-1580-4 ","The CRISPR/Cas9 system has recently been engineered to confer resistance to geminiviruses in plants. However, we show here that the usefulness of this antiviral strategy is undermined by off-target effects identified by deep sequencing in Arabidopsis. We construct two virus-inducible CRISPR/Cas9 vectors that efficiently inhibit beet severe curly top virus (BSCTV) accumulation in both transient assays (Nicotiana benthamiana) and transgenic lines (Arabidopsis). Deep sequencing detects no off-target effect in candidate sites of the transgenic Arabidopsis. This kind of virus-inducible genome-editing system should be widely  applicable for generating virus-resistant plants without off-target costs.","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","CRISPR / Cas9システムは最近、植物にジェミニウイルスに対する耐性を与えるように設計されました。ただし、ここでは、この抗ウイルス戦略の有用性が、シロイヌナズナのディープシーケンスによって特定されたオフターゲット効果によって損なわれていることを示しています。一過性アッセイ（Nicotianabenthamiana）とトランスジェニック系統（Arabidopsis）の両方でビート重症カーリートップウイルス（BSCTV）の蓄積を効率的に阻害する2つのウイルス誘導性CRISPR / Cas9ベクターを構築します。ディープシーケンシングは、トランスジェニックシロイヌナズナの候補部位でオフターゲット効果を検出しません。この種のウイルス誘導性ゲノム編集システムは、オフターゲットコストなしでウイルス耐性植物を生成するために広く適用できるはずです。"]
[34,29051052,"plant","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;"," ","Virus research","Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis.",2018,"244:333-337","[Ali Z et al.]","King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia.",29051052,"10.1016/j.virusres.2017.10.009 ","The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas9) system has enabled efficient genome engineering in diverse plant species. However, delivery of genome engineering reagents, such  as the single guide RNA (sgRNA), into plant cells remains challenging. Here, we report the engineering of Tobacco rattle virus (TRV) and Pea early browning virus (PEBV) to deliver one or multiple sgRNAs into Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana (Col-0) plants that overexpress a nuclear localization signal containing Cas9. Our data showed that TRV and PEBV can deliver sgRNAs into inoculated and systemic leaves, and this resulted in mutagenesis of the targeted  genomic loci. Moreover, in N. benthamiana, PEBV-based sgRNA delivery resulted in  more targeted mutations than TRV-based delivery. Our data indicate that TRV and PEBV can facilitate plant genome engineering and can be used to produce targeted  mutations for functional analysis and other biotechnological applications across  diverse plant species. Key message: Delivery of genome engineering reagents into  plant cells is challenging and inefficient and this limit the applications of this technology in many plant species. RNA viruses such as TRV and PEBV provide an efficient tool to systemically deliver sgRNAs for targeted genome modification.","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連（Cas9）システムは、多様な植物種で効率的なゲノムエンジニアリングを可能にしました。ただし、シングルガイドRNA（sgRNA）などのゲノムエンジニアリング試薬の植物細胞への送達は依然として困難です。ここでは、Cas9を含む核局在化シグナルを過剰発現するNicotianabenthamianaおよびArabidopsisthaliana（Col-0）植物に1つまたは複数のsgRNAを送達するためのタバコガラガラウイルス（TRV）およびエンドウ豆早期褐変ウイルス（PEBV）のエンジニアリングについて報告します。私たちのデータは、TRVとPEBVがsgRNAを接種された全身の葉に送達できることを示しており、これにより、標的となるゲノム遺伝子座の突然変異誘発が生じました。さらに、ベンサミアナタバコでは、PEBVベースのsgRNAデリバリーは、TRVベースのデリバリーよりも多くの標的変異をもたらしました。私たちのデータは、TRVとPEBVが植物ゲノム工学を促進し、多様な植物種にわたる機能分析やその他の生物工学的応用のための標的変異を生成するために使用できることを示しています。重要なメッセージ：ゲノム工学試薬の植物細胞への送達は困難で非効率的であり、これにより多くの植物種でのこの技術の適用が制限されます。TRVやPEBVなどのRNAウイルスは、標的ゲノム修飾のためにsgRNAを体系的に送達するための効率的なツールを提供します。"]
[35,29987710,"plant","banana (Cavendish cultivar \"Williams\")","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase (PDS)","Transgenic research","Gene editing the phytoene desaturase alleles of Cavendish banana using CRISPR/Cas9.",2018,"27(5):451-460","[Naim F  et al.]","Queensland University of Technology, Brisbane, QLD, Australia.",29987710,"10.1007/s11248-018-0083-0 ","Bananas are a staple food source and a major export commodity worldwide. The Cavendish dessert banana is a triploid AAA genome type and accounts for around 47% of global production. Being essentially sterile, genetic modification is perhaps the only pathway available to improve this cultivar. In this study, we used the CRISPR/Cas9 gene editing system to deliver a self-cleaving polycistronic guide RNA (gRNA) designed to target exon 1 of the Phytoene desaturase (PDS) gene  in the Cavendish cultivar \"Williams\". Genotyping of 19 independent events showed  a 100% PDS modification rate primarily in the form of insertions (1-105 nt) or deletions (1-55 nt) (indels) at the predicted cleavage site. Tri-allelic disruptive modifications were observed in 63% of plants and resulted in both albinism and dwarfing. Pale green (16%) and wildtype green (21%) phenotypes generally correlated with in-frame indels in at least one of the three PDS alleles. Editing efficiency was dependent on both target site selection and Cas9  abundance. This is the first report of a highly effective CRISPR/Cas9 modification system using a polycistronic gRNA in Cavendish banana. Such an editing platform will be of considerable utility for the development of disease resistance and novel agro-traits in this commercially important cultivar into the future.","banana","バナナは主食であり、世界中の主要な輸出商品です。キャベンディッシュデザートバナナは三倍体のAAAゲノムタイプであり、世界の生産量の約47％を占めています。本質的に不稔であるため、遺伝子組み換えはおそらくこの栽培品種を改善するために利用できる唯一の経路です。この研究では、CRISPR / Cas9遺伝子編集システムを使用して、キャベンディッシュ栽培品種「ウィリアムズ」のフィトエン不飽和化酵素（PDS）遺伝子のエクソン1を標的とするように設計された自己切断ポリシストロンガイドRNA（gRNA）を提供しました。19の独立したイベントの遺伝子型決定は、予測された切断部位での挿入（1〜105 nt）または欠失（1〜55 nt）（インデル）の形で主に100％のPDS修飾率を示しました。三対立遺伝子の破壊的修飾が63％の植物で観察され、白皮症と矮化の両方をもたらしました。淡い緑色（16％）と野生型の緑色（21％）の表現型は、一般に3つのPDS対立遺伝子の少なくとも1つでインフレームインデルと相関していました。編集効率は、ターゲットサイトの選択とCas9の存在量の両方に依存していました。これは、キャベンディッシュバナナでポリシストロン性gRNAを使用した非常に効果的なCRISPR / Cas9修飾システムの最初の報告です。このような編集プラットフォームは、将来この商業的に重要な栽培品種における耐病性と新しい農業形質の開発にかなりの有用性があります。"]
[36,29188477,"plant","banana (cv. Rasthali)","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase (RAS-PDS)","Functional & integrative genomics","CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase (PDS) demonstrates  precise manipulation in banana cv. Rasthali genome.",2018,"18(1):89-99","[Kaur N et al.]","National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI), Ministry of Science and Technology (Government of India), Mohali, Punjab, India.",29188477,"10.1007/s10142-017-0577-5 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) has been reported for precise genome  modification in many plants. In the current study, we demonstrate a successful mutation in phytoene desaturase (RAS-PDS) of banana cv. Rasthali using the CRISPR/Cas9 system. Two PDS genes were isolated from Rasthali (RAS-PDS1 and RAS-PDS2), and their protein sequence analysis confirmed that both PDS comprises  conserved motifs for enzyme activity. Phylogenetic analysis of RAS-PDS1 and RAS-PDS2 revealed a close evolutionary relationship with other monocot species. The tissue-specific expression profile of RAS-PDS1 and RAS-PDS2 in Rasthali suggested differential regulation of the genes. A single 19-bp guide RNA (gRNA) was designed to target the conserved region of these two RAS-PDS and transformed  with Cas9 in embryogenic cell suspension (ECS) cultures of cv. Rasthali. Complete albino and variegated phenotype were observed among regenerated plantlets. DNA sequencing of 13 plants confirmed the indels with 59% mutation frequency in RAS-PDS, suggesting activation of the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway.  The majority of mutations were either insertion (1-5) or deletion (1-4) of nucleotides near to protospacer adjacent motif (PAM). These mutations have created stop codons in RAS-PDS sequences which suggest premature termination of RAS-PDS protein synthesis. The decreased chlorophyll and total carotenoid contents were detected in mutant lines that revealed the functional disruption of both RAS-PDS genes. Our results demonstrate that genome editing through CRISPR/Cas9 can be applied as an efficient tool for banana genome modification.","banana","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）は、多くの植物で正確なゲノム修飾が報告されています。現在の研究では、バナナcvのフィトエンデサチュラーゼ（RAS-PDS）の突然変異の成功を示しています。CRISPR / Cas9システムを使用するRasthali。Rasthaliから2つのPDS遺伝子（RAS-PDS1およびRAS-PDS2）が単離され、それらのタンパク質配列分析により、両方のPDSが酵素活性の保存されたモチーフを含むことが確認されました。RAS-PDS1およびRAS-PDS2の系統発生分析により、他の単子葉植物種との密接な進化的関係が明らかになりました。RasthaliにおけるRAS-PDS1およびRAS-PDS2の組織特異的発現プロファイルは、遺伝子の異なる調節を示唆しました。単一の19bpガイドRNA（gRNA）は、これら2つのRAS-PDSの保存領域をターゲットにするように設計され、cvの胚形成細胞懸濁液（ECS）培養でCas9で形質転換されました。ラスタリ。再生された小植物の間で、完全なアルビノと多様な表現型が観察された。13の植物のDNA配列決定により、RAS-PDSで59％の変異頻度を持つインデルが確認され、非相同末端結合（NHEJ）経路の活性化が示唆されました。突然変異の大部分は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の近くのヌクレオチドの挿入（1-5）または欠失（1-4）のいずれかでした。これらの変異により、RAS-PDS配列に終止コドンが作成され、RAS-PDSタンパク質合成の早期終了が示唆されました。クロロフィルと総カロテノイド含有量の減少が変異株で検出され、両方のRAS-PDS遺伝子の機能的破壊が明らかになりました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9によるゲノム編集がバナナゲノム修飾の効率的なツールとして適用できることを示しています。"]
[37,30542354,"plant","barley","Cas9;","cytokinin dehydrogenase (HvCKX1)","Frontiers in plant science","Modification of Barley Plant Productivity Through Regulation of Cytokinin Content by Reverse-Genetics Approaches.",2018,"9:1676","[Holubova K et al.]","Palacky University, Olomouc, Czech Republic.",30542354,"10.3389/fpls.2018.01676 ","Barley is one of the most important cereals, which is used for breweries, animal  and human feeds. Genetic manipulation of plant hormone cytokinins may influence several physiological processes, besides others stress tolerance, root formation  and crop yield. In planta, endogenous cytokinin status is finely regulated by the enzyme cytokinin dehydrogenase (EC 1.5.99.12; CKX), that irreversible degrades the side chain of adenine-derived isoprenoid cytokinins. Increasing grain yield by mean of manipulation of endogenous cytokinin content was assayed by the silencing of the HvCKX1 gene. Moreover, to elucidate the putative role of HvCKX1  gene on grain production, knocked-out Hvckx1 mutant plants were generated using the RNA-guided Cas9 system. Homozygote transgenic plants with silenced HvCKX1 gene and azygous knock-out Hvckx1 mutants have been selected and analyzed. Both reduced expression of HvCKX1 gene and CKX activity were measured in different stages of barley grain development. Phenotyping of the transgenic lines revealed  reduced root growth, however, plants produced more tillers and grains than azygous wild-type controls and the total yield was increased up to 15 per cent. Although plant productivity was increased, total grain biomass was decreased to 80% of WT grains. RNA-seq analysis of knock-down transgenic lines revealed that several important macronutrient transporters were downregulated in the stage of massive starch accumulation. It suggests that local accumulation of cytokinins negatively affected nutrients flow resulting in reduced grain biomass. Obtained results confirmed the key role of HvCKX1 for regulation of cytokinin content in barley.","barley","大麦は最も重要な穀物の1つであり、醸造所、動物、人間の飼料に使用されます。植物ホルモンサイトカイニンの遺伝子操作は、他のストレス耐性、根の形成、および作物収量に加えて、いくつかの生理学的プロセスに影響を与える可能性があります。プランタでは、内因性サイトカイニンの状態は、酵素サイトカイニンデヒドロゲナーゼ（EC 1.5.99.12; CKX）によって細かく制御されており、アデニン由来のイソプレノイドサイトカイニンの側鎖を不可逆的に分解します。内因性サイトキニン含有量の操作による穀物収量の増加は、HvCKX1遺伝子のサイレンシングによってアッセイされた。さらに、穀物生産におけるHvCKX1遺伝子の推定上の役割を解明するために、ノックアウトされたHvckx1変異体植物がRNA誘導Cas9システムを使用して生成されました。沈黙したHvCKX1遺伝子と接合性ノックアウトHvckx1変異体を有するホモ接合体トランスジェニック植物が選択され、分析された。HvCKX1遺伝子の発現低下とCKX活性の両方が、オオムギ穀粒発達のさまざまな段階で測定されました。トランスジェニック系統の表現型は、根の成長の低下を明らかにしましたが、植物は、接合性の野生型対照よりも多くの分げつと穀物を生産し、総収量は最大15パーセント増加しました。植物の生産性は向上しましたが、総穀物バイオマスはWT穀物の80％に減少しました。ノックダウントランスジェニック系統のRNA-seq分析により、いくつかの重要な主要栄養素輸送体が大量のデンプン蓄積の段階でダウンレギュレートされていることが明らかになりました。これは、サイトキニンの局所的な蓄積が栄養素の流れに悪影響を及ぼし、穀物のバイオマスが減少したことを示唆しています。得られた結果は、オオムギのサイトカイニン含有量の調節のためのHvCKX1の重要な役割を確認しました。"]
[38,29577542,"plant","barley","Cas9;","Microrchidia protein (HvMORC1)","Plant biotechnology journal","Further analysis of barley MORC1 using a highly efficient RNA-guided Cas9 gene-editing system.",2018,"16(11):1892-1903","[Kumar N  et al.]","Justus-Liebig University Giessen, Giessen, Germany.",29577542,"10.1111/pbi.12924 ","Microrchidia (MORC) proteins comprise a family of proteins that have been identified in prokaryotes and eukaryotes. They are defined by two hallmark domains: a GHKL-type ATPase and an S5-fold. In plants, MORC proteins were first discovered in a genetic screen for Arabidopsis thaliana mutants compromised for resistance to a viral pathogen. Subsequent studies expanded their role in plant immunity and revealed their involvement in gene silencing and genome stabilization. Little is known about the role of MORC proteins of cereals, especially because knockout (KO) mutants were not available and assessment of loss of function relied only on RNAi strategies, which were arguable, given that  MORC proteins in itself are influencing gene silencing. Here, we used a Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-mediated KO strategy to functionally study HvMORC1, one of the current seven MORC members of barley. Using a novel barley RNA Pol III-dependent U3 small nuclear RNA (snRNA) promoter to drive expression of the synthetic single guide RNA (sgRNA), we achieved a very high mutation frequency in HvMORC1. High frequencies of mutations were detectable by target sequencing in the callus, the T0 generation (77%) and T1 generation (70%-100%), which constitutes an important improvement of the gene-editing technology in cereals. Corroborating and extending earlier findings, SpCas9-edited hvmorc1-KO barley, in clear contrast to Arabidopsis atmorc1 mutants, had a distinct phenotype of increased disease resistance to fungal pathogens, while morc1 mutants of either plant showed de-repressed expression of transposable elements (TEs), substantiating that plant MORC proteins contribute to genome stabilization in monocotyledonous and dicotyledonous plants.","barley","Microrchidia（MORC）タンパク質は、原核生物と真核生物で同定されているタンパク質のファミリーで構成されています。それらは、GHKL型ATPaseとS5フォールドの2つの特徴的なドメインによって定義されます。植物では、MORCタンパク質は、ウイルス性病原体に対する耐性が損なわれたシロイヌナズナ変異体の遺伝子スクリーニングで最初に発見されました。その後の研究により、植物の免疫における役割が拡大し、遺伝子サイレンシングとゲノム安定化への関与が明らかになりました。特にノックアウト（KO）変異体が利用できず、機能喪失の評価は、MORCタンパク質自体が遺伝子サイレンシングに影響を及ぼしていることを考えると、議論の余地のあるRNAi戦略のみに依存していたため、穀物のMORCタンパク質の役割についてはほとんど知られていません。ここでは、Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）を介したKO戦略を使用して、現在の大麦の7つのMORCメンバーの1つであるHvMORC1を機能的に研究しました。新規の大麦RNAPol III依存U3小核RNA（snRNA）プロモーターを使用して、合成シングルガイドRNA（sgRNA）の発現を促進し、HvMORC1で非常に高い変異頻度を達成しました。高頻度の突然変異は、カルス、T0世代（77％）およびT1世代（70％-100％）のターゲットシーケンシングによって検出されました。これは、穀物の遺伝子編集技術の重要な改善を構成します。以前の発見を裏付け、拡張する、SpCas9編集hvmorc1-KOオオムギは、シロイヌナズナatmorc1変異体とは明らかに対照的に、真菌病原体に対する耐病性の増加という明確な表現型を示したが、いずれかの植物のmorc1変異体は転移因子（TE ）、植物のMORCタンパク質が単子葉植物および双子葉植物のゲノム安定化に寄与することを実証します。"]
[39,30568723,"plant","barley (Hordeum vulgare L.)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","cytokinin oxidase/dehydrogenase (HvCKX1; HvCKX3); Nud","Plant methods","A simple and efficient CRISPR/Cas9 platform for induction of single and multiple, heritable mutations in barley (Hordeum vulgare L.).",2018,"14:111","[Gasparis S  et al.]","Plant Breeding and Acclimatization Institute - National Research Institute, Blonie, Poland.",30568723,"10.1186/s13007-018-0382-8 ","Background: Genome editing of monocot plants can be accomplished by using the components of the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic  repeat/CRISPR associated Cas9) technology specifically optimized for these types  of plants. Here, we present the development of RNA-guided Cas9 system for simplex and multiplex genome editing in barley. Results: We developed a set of customizable RNA-guided Cas9 binary vectors and sgRNA modules for simplex and multiplex editing in barley. To facilitate the design of RNA-guided Cas9 constructs, the pBract derived binary vectors were adapted to Gateway cloning and only one restriction enzyme was required for construction of the sgRNA. We designed a synthetic, codon optimized Cas9 gene containing the N terminal SV40 nuclear localization signal and the UBQ10 Arabidopsis 1st intron. Two different sgRNAs were constructed for simplex editing and one polycistronic tRNA-gRNA construct (PTG) for multiplex editing using an endogenous tRNA processing system. The RNA-guided Cas9 constructs were validated in transgenic barley plants produced by Agrobacterium-mediated transformation. The highest mutation rate was  observed in simplex editing of the cytokinin oxidase/dehydrogenase HvCKX1 gene, where mutations at the hvckx1 locus were detected in 88% of the screened T0 plants. We also proved the efficacy of the PTG construct in the multiplex editing of two CKX genes by obtaining 9 plants (21% of all edited plants) with mutations  induced in both HvCKX1 and HvCKX3. Analysis of the T1 lines revealed that mutations in the HvCKX1 gene were transmitted to the next generation of plants. Among 220 screened T1 plants we identified 85 heterozygous and 28 homozygous mutants, most of them bearing frameshift mutations in the HvCKX1 gene. We also observed independent segregation of mutations and the Cas9-sgRNA T-DNA insert in  several T1 plants. Moreover, the knockout mutations of the Nud gene generated phenotype mutants with naked grains, and the phenotypic changes were identifiable in T0 plants. Conclusions: We demonstrated the effectiveness of an optimized RNA-guided Cas9 system that can be used for generating homozygous knockout mutants in the progeny of transgenic barely plants. This is also the first report of successful multiplex editing in barley using a tRNA processing system.","barley","背景：単子葉植物のゲノム編集は、これらのタイプの植物用に特別に最適化されたCRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連Cas9）テクノロジーのコンポーネントを使用して行うことができます。ここでは、オオムギのシンプレックスおよびマルチプレックスゲノム編集のためのRNAガイドCas9システムの開発を紹介します。結果：大麦でのシンプレックスおよびマルチプレックス編集用に、カスタマイズ可能なRNAガイドCas9バイナリベクターとsgRNAモジュールのセットを開発しました。RNAガイドCas9コンストラクトの設計を容易にするために、pBract由来のバイナリーベクターをゲートウェイクローニングに適合させ、sgRNAの構築に必要な制限酵素は1つだけでした。N末端SV40核局在化シグナルとUBQ10アラビドプシス第1イントロンを含む合成のコドン最適化Cas9遺伝子を設計しました。シンプレックス編集用に2つの異なるsgRNAを構築し、内因性tRNAプロセッシングシステムを使用したマルチプレックス編集用に1つのポリシストロン性tRNA-gRNAコンストラクト（PTG）を構築しました。RNA誘導Cas9コンストラクトは、アグロバクテリウムを介した形質転換によって生産されたトランスジェニックオオムギ植物で検証されました。最高の突然変異率は、サイトカイニンオキシダーゼ/デヒドロゲナーゼHvCKX1遺伝子のシンプレックス編集で観察され、hvckx1遺伝子座での突然変異がスクリーニングされたT0植物の88％で検出されました。また、HvCKX1とHvCKX3の両方で変異が誘発された9つの植物（編集されたすべての植物の21％）を取得することにより、2つのCKX遺伝子の多重編集におけるPTGコンストラクトの有効性を証明しました。T1系統の分析により、HvCKX1遺伝子の変異が次世代の植物に伝達されたことが明らかになりました。スクリーニングされた220のT1植物の中で、85のヘテロ接合変異体と28のホモ接合変異体を同定しました。それらのほとんどはHvCKX1遺伝子にフレームシフト変異を持っています。また、いくつかのT1植物で、突然変異の独立した分離とCas9-sgRNAT-DNAインサートを観察しました。さらに、Nud遺伝子のノックアウト変異は、裸の穀粒を持つ表現型変異体を生成し、表現型の変化はT0植物で識別可能でした。結論：トランスジェニックかろうじて植物の子孫でホモ接合性ノックアウト変異体を生成するために使用できる最適化されたRNA誘導Cas9システムの有効性を実証しました。これは、tRNA処理システムを使用した大麦でのマルチプレックス編集の成功に関する最初の報告でもあります。"]
[40,30283481,"plant","Brassica carinata","CRISPR;Cas9;","P-specific reacting genes; four genes that reacted specifically to Pi starvation including fasciclin-like arabinogalactan protein 1; inorganic phosphate transporter","Frontiers in plant science","Molecular Background of Pi Deficiency-Induced Root Hair Growth in Brassica carinata - A Fasciclin-Like Arabinogalactan Protein Is Involved.",2018,"9:1372","[Kirchner TW et al.]","Leibniz Universitat Hannover, Hanover, Germany.",30283481,"10.3389/fpls.2018.01372 ","Formation of longer root hairs under limiting phosphate (P) conditions can increase the inorganic P (Pi) uptake. Here, regulatory candidate genes for Pi deficiency-induced root hair growth were identified by comparison of massive analysis of cDNA ends (MACE) provided expression profiles of two Brassica carinata cultivars (cv.) differing in their root hair response to Pi deficiency:  cv. Bale develops longer root hairs under Pi deficiency, but not cv. Bacho. A split-root experiment was conducted for the differentiation between locally and systemically regulated genes. Furthermore, plants were exposed to nitrogen and potassium deficiency to identify P-specific reacting genes. The latter were knocked out by CRISPR/Cas9 and the effect on the root hair length was determined. About 500 genes were differentially expressed under Pi deficiency in cv. Bale, while these genes did not respond to the low P supply in cv. Bacho. Thirty-three  candidate genes with a potential regulatory role were selected and the transcriptional regulation of 30 genes was confirmed by quantitative PCR. Only five candidate genes seemed to be either exclusively regulated locally (two) or systemically (three), whereas 25 genes seemed to be involved in both local and systemic signaling pathways. Potassium deficiency affected neither the root hair  length nor the expression of the 30 candidate genes. By contrast, both P and nitrogen deficiency increased the root hair length, and both affected the transcript levels in 26 cases. However, four genes reacted specifically to Pi starvation. These genes and, additionally, INORGANIC PHOSPHATE TRANSPORTER 1 (BcPHT1) were targeted by CRISPR/Cas9. However, even if the transcript levels of  five of these genes were clearly decreased, FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 1 (BcFLA1) was the only gene whose downregulation reduced the root hair length in transgenic hairy roots under Pi-deficient conditions. To the best of our knowledge, this is the first study describing a fasciclin-like arabinogalactan protein with a predicted role in the Pi deficiency-induced root hair elongation.","Brassica","制限されたリン酸塩（P）条件下でより長い根毛が形成されると、無機P（Pi）の取り込みが増加する可能性があります。ここでは、Pi欠乏による根毛の成長の調節候補遺伝子は、Pi欠乏に対する根毛の反応が異なる2つのBrassica carinata栽培品種（cv。）の発現プロファイルを提供するcDNA末端の大規模分析（MACE）の比較によって特定されました：cv。ベールはPi欠乏下でより長い根毛を発達させますが、cvは発達させません。バチョ。局所的および全身的に調節される遺伝子を区別するために、分割根実験を行った。さらに、植物は、P特異的反応遺伝子を同定するために窒素とカリウムの欠乏にさらされました。後者はCRISPR / Cas9によってノックアウトされ、根毛の長さへの影響が決定されました。約500の遺伝子がcvのPi欠乏下で差次的に発現された。ベール、これらの遺伝子はcvの低いP供給に応答しませんでした。バチョ。潜在的な調節の役割を持つ33の候補遺伝子が選択され、30の遺伝子の転写調節が定量的PCRによって確認されました。5つの候補遺伝子のみが局所的（2）または全身的（3）に排他的に調節されているようでしたが、25の遺伝子は局所的および全身的シグナル伝達経路の両方に関与しているようでした。カリウム欠乏症は、根毛の長さにも30の候補遺伝子の発現にも影響を与えませんでした。対照的に、Pと窒素の両方の欠乏は根の毛の長さを増加させ、両方とも26例の転写レベルに影響を及ぼしました。しかし、4つの遺伝子がPi飢餓に特異的に反応しました。これらの遺伝子、さらに無機リン酸トランスポーター1（BcPHT1）は、CRISPR / Cas9の標的となりました。しかし、これらの遺伝子のうち5つの転写レベルが明らかに低下したとしても、FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 1（BcFLA1）は、Pi欠損条件下でトランスジェニック毛根の根毛長をダウンレギュレーションが低下させた唯一の遺伝子でした。私たちの知る限りでは、これは、Pi欠乏によって誘発される根の毛の伸長において予測される役割を持つファシクリン様アラビノガラクタンタンパク質を説明する最初の研究です。"]
[41,29616073,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","APETALA2 (BnAP2)","Frontiers in plant science","Defective APETALA2 Genes Lead to Sepal Modification in Brassica Crops.",2018,"9:367","[Zhang Y et al.]","Hybrid Rapeseed Research Center of Shaanxi Province, Yangling, China.",29616073,"10.3389/fpls.2018.00367 ","Many vegetable and oilseed crops belong to Brassica species. The seed production  of these crops is hampered often by abnormal floral organs, especially under the  conditions of abiotic conditions. However, the molecular reasons for these abnormal floral organs remains poorly understood. Here, we report a novel pistil-like flower mutant of B. rapa. In the flower of this mutant, the four sepals are modified to one merged carpel that look like a ring in the sepal positions, enveloping some abnormal stamens and a pistil, and resulting in poor seed production. This novel mutant is named sepal-carpel modification (scm). DNA  sequencing showed that the BrAP2a gene, the ortholog of Arabidopsis APETALA2 (AP2) that specifies sepal identity, losses the function of in scm mutant due to  a 119-bp repeated sequence insertion that resulted in an early transcription termination. BrAP2b, the paralog of BrAP2a featured two single-nucleotide substitutions that cause a single amino acid substitution in the highly conserved acidic serine-rich transcriptional activation domain. Each of the two BrAP2 genes rescues the sepal defective phenotype of the ap2-5 mutant of Arabidopsis. Furthermore, the knockout mutation of the corresponding BnAP2 genes of oilseed rape (B. napus) by CRISPR/Cas9-mediated genome editing system resulted in scm-like phenotype. These results suggest that BrAP2 gene plays a key role in sepal modification. Our finding provides an insight into molecular mechanism underlying morphological modification of floral organs and is useful for genetic  manipulation of flower modification and improvement of seed production of Brassica crops.","brassica","多くの野菜や油糧種子の作物はアブラナ属の種に属しています。これらの作物の種子生産は、特に非生物的条件下で、異常な花器官によってしばしば妨げられます。ただし、これらの異常な花器官の分子的理由はよくわかっていないままです。ここでは、B。ラパの新しい雌しべのような花の変異体を報告します。この突然変異体の花では、4つのがく片が、がく片の位置でリングのように見える1つの結合されたがく片に変更され、いくつかの異常な雄しべと雌しべを包み込み、種子の生産が不十分になります。この新しい変異体は、sepal-carpelmodification（scm）と呼ばれます。DNAシーケンスにより、Sepalアイデンティティを指定するArabidopsis APETALA2（AP2）のオルソログであるBrAP2a遺伝子は、119 bpの繰り返しシーケンス挿入により、scm変異体の機能を失い、早期の転写終了が生じることが示されました。BrAP2aのパラログであるBrAP2bは、高度に保存された酸性セリンリッチ転写活性化ドメインで単一のアミノ酸置換を引き起こす2つの単一ヌクレオチド置換を特徴としていました。2つのBrAP2遺伝子のそれぞれは、シロイヌナズナのap2-5変異体のがく片欠損表現型を救助します。さらに、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集システムによるナタネ（B. napus）の対応するBnAP2遺伝子のノックアウト変異は、scmのような表現型をもたらしました。これらの結果は、BrAP2遺伝子が分離修飾において重要な役割を果たしていることを示唆しています。私たちの発見は、花器官の形態学的修飾の根底にある分子メカニズムへの洞察を提供し、花修飾の遺伝子操作およびブラッシカ作物の種子生産の改善に有用です。"]
[42,30208656,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","BnWRKY11; BnWRKY70","International journal of molecular sciences","CRISPR/Cas9-Mediated Multiplex Genome Editing of the BnWRKY11 and BnWRKY70 Genes  in Brassica napus L.",2018,"19(9)","[Sun Q et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",30208656,"10.3390/ijms19092716 ","Targeted genome editing is a desirable means of basic science and crop improvement. The clustered, regularly interspaced, palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 (CRISPR-associated 9) system is currently the simplest and most commonly used system in targeted genomic editing in plants. Single and multiplex  genome editing in plants can be achieved under this system. In Arabidopsis, AtWRKY11 and AtWRKY70 genes were involved in JA- and SA-induced resistance to pathogens, in rapeseed (Brassica napus L.), BnWRKY11 and BnWRKY70 genes were found to be differently expressed after inoculated with the pathogenic fungus, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. In this study, two Cas9/sgRNA constructs targeting two copies of BnWRKY11 and four copies of BnWRKY70 were designed to generate BnWRKY11 and BnWRKY70 mutants respectively. As a result, twenty-two BnWRKY11 and eight BnWRKY70 independent transformants (T(0)) were obtained, with  the mutation ratios of 54.5% (12/22) and 50% (4/8) in BnWRKY11 and BnWRKY70 transformants respectively. Eight and two plants with two copies of mutated BnWRKY11 and BnWRKY70 were obtained respectively. In T(1) generation of each plant examined, new mutations on target genes were detected with high efficiency. The vast majority of BnWRKY70 mutants showed editing in three copies of BnWRKY70  in examined T(1) plants. BnWRKY70 mutants exhibited enhanced resistance to Sclerotinia, while BnWRKY11 mutants showed no significant difference in Sclerotinia resistance when compared to non-transgenic plants. In addition, plants that overexpressed BnWRKY70 showed increased sensitivity when compared to  non-transgenic plants. Altogether, our results demonstrated that BnWRKY70 may function as a regulating factor to negatively control the Sclerotinia resistance  and CRISPR/Cas9 system could be used to generate germplasm in B. napus with high  resistance against Sclerotinia.","brassica","ターゲットを絞ったゲノム編集は、基礎科学と作物改良の望ましい手段です。クラスター化された、規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9（CRISPR関連9）システムは、現在、植物の標的ゲノム編集で最も単純で最も一般的に使用されているシステムです。このシステムでは、植物の単一および多重ゲノム編集を実現できます。アラビドプシスでは、AtWRKY11およびAtWRKY70遺伝子がJAおよびSA誘発性の病原体耐性に関与しており、菜種（Brassica napus L.）では、BnWRKY11およびBnWRKY70遺伝子は、病原性真菌であるSclerotinia sclerotiorum（Lib 。）deBary。この研究では、BnWRKY11の2つのコピーとBnWRKY70の4つのコピーをターゲットとする2つのCas9 / sgRNAコンストラクトが、それぞれBnWRKY11とBnWRKY70変異体を生成するように設計されました。その結果、22個のBnWRKY11と8個のBnWRKY70独立形質転換体（T（0））が得られ、BnWRKY11とBnWRKY70形質転換体の突然変異率はそれぞれ54.5％（12/22）と50％（4/8）でした。変異したBnWRKY11とBnWRKY70の2つのコピーを持つ8つと2つの植物がそれぞれ得られました。調べた各植物のT（1）世代では、標的遺伝子の新しい突然変異が高効率で検出されました。BnWRKY70変異体の大多数は、調べたT（1）植物でBnWRKY70の3つのコピーで編集を示しました。BnWRKY70変異体は、スクレロチニアに対する耐性の増強を示したが、BnWRKY11変異体は、非トランスジェニック植物と比較した場合、スクレロチニア耐性に有意差を示さなかった。さらに、BnWRKY70を過剰発現した植物は、非トランスジェニック植物と比較して感度の増加を示しました。まとめると、我々の結果は、BnWRKY70がスクレロチニア耐性を負に制御する調節因子として機能する可能性があり、CRISPR / Cas9システムを使用してスクレロチニアに対して高い耐性を持つセイヨウアブラナの生殖質を生成できることを示しました。"]
[43,29250878,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","CLAVATA","Plant biotechnology journal","Precise editing of CLAVATA genes in Brassica napus L. regulates multilocular silique development.",2018,"16(7):1322-1335","[Yang Y  et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",29250878,"10.1111/pbi.12872 ","Multilocular silique is a desirable agricultural trait with great potential for the development of high-yield varieties of Brassica. To date, no spontaneous or induced multilocular mutants have been reported in Brassica napus, which likely reflects its allotetraploid nature and the extremely low probability of the simultaneous random mutagenesis of multiple gene copies with functional redundancy. Here, we present evidence for the efficient knockout of rapeseed homologues of CLAVATA3 (CLV3) for a secreted peptide and its related receptors CLV1 and CLV2 in the CLV signalling pathway using the CRISPR/Cas9 system and achieved stable transmission of the mutations across three generations. Each BnCLV gene has two copies located in two subgenomes. The multilocular phenotype can be recovered only in knockout mutations of both copies of each BnCLV gene, illustrating that the simultaneous alteration of multiple gene copies by CRISPR/Cas9 mutagenesis has great potential in generating agronomically important mutations in rapeseed. The mutagenesis efficiency varied widely from 0% to 48.65% in T0 with different single-guide RNAs (sgRNAs), indicating that the appropriate  selection of the sgRNA is important for effectively generating indels in rapeseed. The double mutation of BnCLV3 produced more leaves and multilocular siliques with a significantly higher number of seeds per silique and a higher seed weight than the wild-type and single mutant plants, potentially contributing to increased seed production. We also assessed the efficiency of the horizontal transfer of Cas9/gRNA cassettes by pollination. Our findings reveal the potential for plant breeding strategies to improve yield traits in currently cultivated rapeseed varieties.","brassica","多房性シリックは、ブラッシカの高収量品種の開発に大きな可能性を秘めた望ましい農業特性です。現在まで、Brassicanapusでは自発的または誘発された多房性変異体は報告されていません。これはおそらくその異質四倍体の性質と機能的冗長性を伴う複数の遺伝子コピーの同時ランダム変異誘発の非常に低い確率を反映しています。ここでは、CRISPR / Cas9システムを使用してCLVシグナル伝達経路で分泌ペプチドとその関連受容体CLV1およびCLV2のCLAVATA3（CLV3）の菜種相同体の効率的なノックアウトの証拠を提示し、3世代にわたって変異の安定した伝達を達成しました。各BnCLV遺伝子には、2つのサブゲノムに2つのコピーがあります。多房性表現型は、各BnCLV遺伝子の両方のコピーのノックアウト変異でのみ回復できます。これは、CRISPR / Cas9変異誘発による複数の遺伝子コピーの同時変更が、菜種に農業的に重要な変異を生成する大きな可能性があることを示しています。突然変異誘発効率は、異なるシングルガイドRNA（sgRNA）を使用したT0で0％から48.65％まで大きく変動し、菜種でインデルを効果的に生成するにはsgRNAの適切な選択が重要であることを示しています。BnCLV3の二重変異は、野生型および単一変異植物よりも、シリックあたりの種子数が大幅に多く、種子重量が多い、より多くの葉と多房性シリックを生成し、種子生成の増加に寄与する可能性があります。また、受粉によるCas9 / gRNAカセットの水平伝播の効率を評価しました。私たちの調査結果は、現在栽培されている菜種品種の収量特性を改善するための植物育種戦略の可能性を明らかにしています。"]
[44,29797624,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","homologues of the Arabidopsis histone 3 lysine 36 (H3K36) methyltransferase SDG8 (BnaSDG8.A; BnaSDG8.C)","Plant journal","Histone lysine methyltransferases BnaSDG8.A and BnaSDG8.C are involved in the floral transition in Brassica napus.",2018,null,"[Jiang L et al.]","Hunan Agricultural University, Changsha, China.",29797624,"10.1111/tpj.13978 ","Although increasing experimental evidence demonstrates that histone methylations  play important roles in Arabidopsis plant growth and development, little information is available regarding Brassica napus. In this study, we characterized two genes encoding homologues of the Arabidopsis histone 3 lysine 36 (H3K36) methyltransferase SDG8, namely, BnaSDG8.A and BnaSDG8.C. Although no duplication of SDG8 homologous genes had been previously reported to occur during the evolution of any sequenced species, a domain-duplication was uncovered in BnaSDG8.C. This duplication led to the identification of a previously unknown NNH domain in the SDG8 homologues, providing a useful reference for future studies and revealing the finer mechanism of SDG8 function. One NNH domain is present in  BnaSDG8.A, while two adjacent NNH domains are present in BnaSDG8.C. Reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction analysis revealed similar patterns but with varied levels of expression of BnaSDG8.A/C in different plant organs/tissues. To directly investigate their function, BnaSDG8.A/C cDNA was ectopically expressed to complement the Arabidopsis mutant. We observed that the  expression of either BnaSDG8.A or BnaSDG8.C could rescue the Arabidopsis sdg8 mutant to the wild-type phenotype. Using RNAi and CRISPR/Cas9-mediated gene editing, we obtained BnaSDG8.A/C knockdown and knockout mutants with the early flowering phenotype as compared with the control. Further analysis of two types of the mutants revealed that BnaSDG8.A/C are required for H3K36 m2/3 deposition and prevent the floral transition of B. napus by directly enhancing the H3K36 m2/3 levels at the BnaFLC chromatin loci. This observation on the floral transition by epigenetic modification in B. napus provides useful information for breeding early-flowering varieties.","brassica","実験的証拠の増加は、ヒストンのメチル化がアラビドプシスの植物の成長と発達に重要な役割を果たしていることを示していますが、Brassicanapusに関する情報はほとんどありません。この研究では、Arabidopsisヒストン3リジン36（H3K36）メチルトランスフェラーゼSDG8のホモログをコードする2つの遺伝子、すなわちBnaSDG8.AとBnaSDG8.Cを特徴づけました。SDG8相同遺伝子の重複は、シーケンスされた種の進化中に発生することが以前に報告されていませんでしたが、ドメインの重複はBnaSDG8.Cで発見されました。この重複により、SDG8ホモログでこれまで知られていなかったNNHドメインが特定され、将来の研究に役立つリファレンスが提供され、SDG8機能のより細かいメカニズムが明らかになりました。1つのNNHドメインがBnaSDG8.Aに存在し、2つの隣接するNNHドメインがBnaSDG8.Cに存在します。逆転写酵素-定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析は、同様のパターンを明らかにしましたが、異なる植物器官/組織におけるBnaSDG8.A / Cの発現レベルは異なります。それらの機能を直接調査するために、BnaSDG8.A / CcDNAを異所的に発現させてシロイヌナズナ変異体を補完しました。BnaSDG8.AまたはBnaSDG8.Cのいずれかの発現が、シロイヌナズナのsdg8変異体を野生型の表現型に救済できることを観察しました。RNAiとCRISPR / Cas9を介した遺伝子編集を使用して、コントロールと比較して早期開花表現型を持つBnaSDG8.A / Cノックダウンおよびノックアウト変異体を取得しました。2種類の変異体をさらに分析すると、BnaSDG8.A / CがH3K36m2 / 3の沈着に必要であり、BnaFLCクロマチン遺伝子座でH3K36 m2 / 3レベルを直接高めることにより、B。napusの花の移行を防ぐことが明らかになりました。セイヨウアブラナにおけるエピジェネティック修飾による花の移行に関するこの観察は、早咲きの品種を育種するための有用な情報を提供します。"]
[45,29753601,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","fatty acid desaturase 2","Plant physiology and biochemistry","CRISPR/Cas9-mediated genome editing of the fatty acid desaturase 2 gene in Brassica napus.",2018,"131:63-69","[Okuzaki A et al.]","Tamagawa University,Machida, Tokyo, Japan.",29753601,"10.1016/j.plaphy.2018.04.025 ","The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-mediated genome editing system has been widely applied as a powerful tool for modifying preferable endogenous genes. This system is highly expected to be further applied for the breeding of various agronomically important plant species. Here we report the modification of a fatty acid desaturase 2 gene (FAD2), which encodes an enzyme that catalyzes the desaturation of oleic acid, in Brassica napus cv. Westar using the CRISPR/Cas9 system. Two guide RNAs were designed for BnaA.FAD2.a (FAD2_Aa). Of 22 regenerated shoots with FAD2_Aa editing vectors, three contained mutant alleles. Further analysis revealed that two of three mature plants (Aa1#13 and Aa2#2) contained the mutant  alleles. The mutant fad2_Aa allele had a 4-bp deletion, which was inherited by backcross progenies (BC1) in the Aa1#13 line. Furthermore, plants with the fad2_Aa allele without transgenes were selected from the BC1 progenies and plants homozygous for fad2_Aa were then produced by self-crossing these BC1 progenies (BC1S1). Fatty acid composition analysis of their seeds revealed a statistically  significant increase in the content of oleic acid compared with that in wild-type seeds. These results showed that the application of the CRISPR/Cas9 system is useful to produce desirable mutant plants with an agronomically suitable phenotype by modifying the metabolic pathway in B. napus.","brassica","CRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）/ Cas9を介したゲノム編集システムは、好ましい内因性遺伝子を変更するための強力なツールとして広く適用されています。このシステムは、農業上重要なさまざまな植物種の育種にさらに応用されることが大いに期待されています。ここでは、セイヨウアブラナのオレイン酸の不飽和化を触媒する酵素をコードする脂肪酸デサチュラーゼ2遺伝子（FAD2）の修飾を報告します。CRISPR / Cas9システムを使用するWestar。2つのガイドRNAがBnaA.FAD2.a（FAD2_Aa）用に設計されました。FAD2_Aa編集ベクターで再生された22のシュートのうち、3つには変異対立遺伝子が含まれていました。さらなる分析により、3つの成熟植物のうち2つ（Aa1＃13およびAa2＃2）に変異対立遺伝子が含まれていることが明らかになりました。変異体fad2_Aa対立遺伝子には4bpの欠失があり、これはAa1＃13系統のバッククロス子孫（BC1）に継承されました。さらに、トランスジーンのないfad2_Aa対立遺伝子を持つ植物が、BC1子孫から選択され、fad2_Aaについてホモ接合性の植物が、これらのBC1子孫（BC1S1）を自己交配することによって生成されました。それらの種子の脂肪酸組成分析は、野生型種子と比較して、オレイン酸の含有量の統計的に有意な増加を明らかにした。これらの結果は、CRISPR / Cas9システムの適用が、セイヨウアブラナの代謝経路を改変することにより、農業的に適切な表現型を持つ望ましい突然変異植物を生産するのに有用であることを示しました。"]
[46,30455712,"plant","Brassica oleracea; Brassica rapa","CRISPR;Cas9;","FRI and PDS genes","Frontiers in plant science","DNA-Free Genome Editing of Brassica oleracea and B. rapa Protoplasts Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoprotein Complexes.",2018,"9:1594","[Murovec J et al.]","University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia.",30455712,"10.3389/fpls.2018.01594 ","The CRISPR/Cas9 genome editing system has already proved its efficiency, versatility and simplicity in numerous applications in human, animal, microbe and plant cells. Together with the vast amount of genome and transcriptome databases  available, it represents an enormous potential for plant breeding and research. Although most changes produced with CRISPR/Cas9 do not differ from naturally occurring mutations, the use of transgenesis during varietal development can still trigger GMO legislation in countries that rely on process-based regulation. Moreover, stable integration of DNA coding for genome-editing tools into plant genomes can result in insertional mutagenesis, while its prolonged expression can cause mutations in off-target sites. These pitfalls can be avoided with the delivery of preassembled ribonucleoprotein complexes (RNPs) composed of purified  recombinant enzyme Cas9 and in vitro-transcribed or synthesized sgRNA. We therefore aimed to develop a DNA-free protocol for site-directed mutagenesis of three species of the genus Brassica (B. oleracea, B. napus, and B. rapa) with the use of RNPs. We chose cabbage, rapeseed and Chinese cabbage as species representatives and introduced RNPs into their protoplasts with PEG 4000. Four sgRNAs targeting two endogenous genes (the FRI and PDS genes, two sgRNAs per gene) were introduced into all three species. No mutations were detected after transfection of rapeseed protoplasts, while we obtained mutation frequencies of 0.09 to 2.25% and 1.15 to 24.51% in cabbage and Chinese cabbage, respectively. In both species, a positive correlation was displayed between the amount (7.5, 15, 30, and 60 mug) of Cas9 enzyme and sgRNA introduced and mutation frequency. Nucleotide changes (insertions and deletions) were detected 24 h after transfection and did not differ 72 h after transfection. They were species-, gene- and locus-dependent. In summary, we demonstrated the suitability of RNP transfection into B. oleracea and B. rapa protoplasts for high-efficiency indel induction of two endogenous genes. Due to the relatively high mutation frequencies detected (up to 24.51%), this study paves the way for regeneration of precisely mutated Brassica plants without the use of transgenesis.","Brassica","CRISPR / Cas9ゲノム編集システムは、ヒト、動物、微生物、植物細胞の多くのアプリケーションで、その効率、汎用性、シンプルさをすでに証明しています。利用可能な膨大な量のゲノムおよびトランスクリプトームデータベースとともに、それは植物の繁殖および研究の大きな可能性を表しています。CRISPR / Cas9で生成されたほとんどの変更は、自然に発生する変異と違いはありませんが、品種開発中にトランスジェネシスを使用すると、プロセスベースの規制に依存する国でGMO法がトリガーされる可能性があります。さらに、ゲノム編集ツールをコードするDNAを植物ゲノムに安定して統合すると、挿入変異が生じる可能性がありますが、その発現が長引くと、オフターゲット部位に変異が生じる可能性があります。これらの落とし穴は、精製された組換え酵素Cas9とinvitroで転写または合成されたsgRNAで構成される組み立て済みのリボヌクレオプロテイン複合体（RNP）を送達することで回避できます。したがって、RNPを使用して、Brassica属の3つの種（B. oleracea、B。napus、およびB. rapa）の部位特異的突然変異誘発のためのDNAフリープロトコルを開発することを目指しました。キャベツ、菜種、白菜を種の代表として選択し、PEG 4000を使用してRNPをプロトプラストに導入しました。2つの内因性遺伝子（FRIおよびPDS遺伝子、遺伝子ごとに2つのsgRNA）をターゲットとする4つのsgRNAを3つの種すべてに導入しました。菜種プロトプラストのトランスフェクション後に変異は検出されませんでしたが、キャベツとチャイニーズキャベツでそれぞれ0.09〜2.25％と1.15〜24.51％の変異頻度が得られました。両方の種で、Cas9酵素と導入されたsgRNAの量（7.5、15、30、および60マグカップ）と突然変異頻度の間に正の相関が示されました。ヌクレオチドの変化（挿入と欠失）はトランスフェクションの24時間後に検出され、トランスフェクションの72時間後に差はありませんでした。それらは種、遺伝子、遺伝子座に依存していました。要約すると、B。oleraceaおよびB. rapaプロトプラストへのRNPトランスフェクションが、2つの内因性遺伝子の高効率インデル誘導に適していることを示しました。検出された変異頻度が比較的高いため（最大24.51％）、この研究は、トランスジェネシスを使用せずに、正確に変異したブラッシカ植物の再生への道を開きます。"]
[47,29569777,"plant","Brassica rapa","RdDM;"," ","Plant journal","Maternal components of RNA-directed DNA methylation are required for seed development in Brassica rapa.",2018,"94(4):575-582","[Grover JW  et al.]","University of Arizona, Tucson, AZ, USA.",29569777,"10.1111/tpj.13910 ","Small RNAs trigger repressive DNA methylation at thousands of transposable elements in a process called RNA-directed DNA methylation (RdDM). The molecular mechanism of RdDM is well characterized in Arabidopsis, yet the biological function remains unclear, as loss of RdDM in Arabidopsis causes no overt defects, even after generations of inbreeding. It is known that 24 nucleotide Pol IV-dependent siRNAs, the hallmark of RdDM, are abundant in flowers and developing seeds, indicating that RdDM might be important during reproduction. Here we show  that, unlike Arabidopsis, mutations in the Pol IV-dependent small RNA pathway cause severe and specific reproductive defects in Brassica rapa. High rates of abortion occur when seeds have RdDM mutant mothers, but not when they have mutant fathers. Although abortion occurs after fertilization, RdDM function is required  in maternal somatic tissue, not in the female gametophyte or the developing zygote, suggesting that siRNAs from the maternal soma might function in filial tissues. We propose that recently outbreeding species such as B. rapa are key to  understanding the role of RdDM during plant reproduction.","brassica","低分子RNAは、RNA指令DNAメチル化（RdDM）と呼ばれるプロセスで、何千もの転移因子で抑制的なDNAメチル化を引き起こします。RdDMの分子メカニズムは、アラビドプシスで十分に特徴付けられていますが、アラビドプシスでのRdDMの喪失は、何世代にもわたる同系交配の後でも明白な欠陥を引き起こさないため、生物学的機能は不明なままです。RdDMの特徴である24ヌクレオチドのPolIV依存性siRNAは、花や発育中の種子に豊富に含まれていることが知られており、RdDMが繁殖中に重要である可能性があることを示しています。ここでは、シロイヌナズナとは異なり、PolIV依存性の低分子RNA経路の変異が、Brassicarapaに深刻で特異的な生殖障害を引き起こすことを示しています。種子にRdDM変異体の母親がいる場合、高い割合の流産が発生しますが、変異体の父親がいる場合は発生しません。流産は受精後に起こりますが、RdDM機能は、雌の配偶体や発育中の接合子ではなく、母体の体細胞組織で必要であり、母体の体細胞からのsiRNAが糸状組織で機能する可能性があることを示唆しています。B. rapaなどの最近の異系交配種が、植物の繁殖におけるRdDMの役割を理解するための鍵となることを提案します。"]
[48,29731757,"plant","rapeseed","CRISPR;Cas9;","BnSPL3-A5; BnSPL3-A4; BnSPL3-C3; BnSPL3-C4; BnSPL3-Cnn","Frontiers in plant science","An Efficient CRISPR/Cas9 Platform for Rapidly Generating Simultaneous Mutagenesis of Multiple Gene Homoeologs in Allotetraploid Oilseed Rape.",2018,"9:442","[Li C et al.]","Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan, China.",29731757,"10.3389/fpls.2018.00442 ","With the rapid development of sequence specific nucleases (SSNs) for genome targeting, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) is now considered the most promising method for functional genetic researches, as well as genetic improvement in crop plants. However, the gene redundancy feature within the allotetraploid rapeseed genome is one of the major obstacles for simultaneous modification of different homologs in the first generation. In addition, large scale screening to identify mutated transgenic plants is very time-and labor-consuming using the conventional restriction enzyme-based approaches. In this study, a streamlined rapeseed CRISPR-Cas9 genome editing platform was developed through synthesizing a premade U6-26 driven sgRNA expression cassette and optimizing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)-based screening approach. In our experiment, a sgRNA was constructed to target five rapeseed SPL3 homologous gene copies, BnSPL3-A5/BnSPL3-A4/BnSPL3-C3/BnSPL3-C4/BnSPL3-Cnn. High-throughput sequencing analysis demonstrated that the editing frequency of CRISPR/Cas9-induced mutagenesis ranged from 96.8 to 100.0% in plants with obvious heteroduplexed PAGE bands, otherwise this proportion was only 0.00-60.8%. Consistent with those molecular analyses, Bnspl3 mutants exhibited developmental  delay phenotype in the first generation. In summary, our data suggest that this set of CRISPR/Cas9 platform is qualified for rapidly generating and identifying simultaneous mutagenesis of multiple gene homologs in allotetraploid rapeseed.","brassica","ゲノムターゲティング用の配列特異的ヌクレアーゼ（SSN）の急速な開発により、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）は、機能的遺伝子研究および遺伝的改善のための最も有望な方法と見なされています。作物植物。ただし、異質四倍体菜種ゲノム内の遺伝子冗長性機能は、第1世代の異なるホモログを同時に変更する際の主要な障害の1つです。さらに、変異したトランスジェニック植物を同定するための大規模なスクリーニングは、従来の制限酵素ベースのアプローチを使用すると、非常に時間と労力を要します。この研究では、合理化された菜種CRISPR-Cas9ゲノム編集プラットフォームが、既製のU6-26駆動sgRNA発現カセットを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）ベースのスクリーニングアプローチを最適化することによって開発されました。私たちの実験では、5つの菜種SPL3相同遺伝子コピーBnSPL3-A5 / BnSPL3-A4 / BnSPL3-C3 / BnSPL3-C4 / BnSPL3-CnnをターゲットとするsgRNAを構築しました。ハイスループットシーケンシング分析により、CRISPR / Cas9誘導突然変異誘発の編集頻度は、明らかなヘテロ二重化PAGEバンドを持つ植物で96.8〜100.0％の範囲であり、そうでない場合、この割合はわずか0.00〜60.8％であることが示されました。これらの分子分析と一致して、Bnspl3変異体は第一世代で発生遅延表現型を示しました。要約すると、私たちのデータは、このCRISPR / Cas9プラットフォームのセットが、異質四倍体菜種における複数の遺伝子ホモログの同時突然変異誘発を迅速に生成および特定するのに適していることを示唆しています。"]
[49,30219987,"plant","rapeseed (Brassica napus L.)","CRISPR;Cas9;","BnA10.LMI1","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","Promoter variations in a homeobox gene, BnA10.LMI1, determine lobed leaves in rapeseed (Brassica napus L.).",2018,"131(12):2699-2708","[Hu L et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30219987,"10.1007/s00122-018-3184-5 ","KEY MESSAGE: BnA10.LMI1 positively regulates the development of leaf lobes in Brassica napus, and cis-regulatory divergences cause the different allele effects. Leaf shape is an important agronomic trait, and large variations in this trait exist within the Brassica germplasm. The lobed leaf is a unique morphological characteristic for Brassica improvement. Nevertheless, the molecular basis of leaf lobing in Brassica is poorly understood. Here, we show that an incompletely dominant locus, BnLLA10, is responsible for the lobed-leaf shape in rapeseed. A LATE MERISTEM IDENTITY1 (LMI1)-like gene (BnA10.LMI1) encoding an HD-Zip I transcription factor is the causal gene underlying the BnLLA10 locus. Sequence analysis of parental alleles revealed no sequence variations in the coding sequences, whereas abundant variations were identified in the regulatory region. Consistent with this finding, the expression levels of  BnLMI1 were substantially elevated in the lobed-leaf parent compared with its near-isogenic line. The knockout mutations of BnA10.LMI1 gene were induced using  the CRISPR/Cas9 system in both HY (the lobed-leaf parent) and J9707 (serrated leaf) genetic backgrounds. BnA10.LMI1 null mutations in the HY background were sufficient to produce unlobed leaves, whereas null mutations in the J9707 background showed no obvious changes in leaf shape compared with the control. Collectively, our results indicate that BnA10.LMI1 positively regulates the development of leaf lobes in B. napus, with cis-regulatory divergences causing the different allelic effects, providing new insights into the molecular mechanism of leaf lobe formation in Brassica crops.","brassica","重要なメッセージ：BnA10.LMI1は、セイヨウアブラナの葉葉の発達を積極的に調節し、シス調節の相違は、さまざまな対立遺伝子効果を引き起こします。葉の形は重要な農業形質であり、この形質には大きな変化がアブラナ属の生殖質内に存在します。葉状の葉は、ブラッシカの改善のための独特の形態学的特徴です。それにもかかわらず、アブラナ属の葉のロビングの分子基盤はよくわかっていません。ここでは、不完全に優勢な遺伝子座BnLLA10が、菜種の葉の形の原因であることを示します。HD-ZipI転写因子をコードする後期分裂組織ID（LMI1）様遺伝子（BnA10.LMI1）は、BnLLA10遺伝子座の根底にある原因遺伝子です。親対立遺伝子の配列分析は、コード配列の配列変異を明らかにしなかったが、調節領域では豊富な変異が同定された。この発見と一致して、BnLMI1の発現レベルは、同質遺伝子に近い系統と比較して、葉のある親で実質的に上昇しました。BnA10.LMI1遺伝子のノックアウト変異は、HY（葉状葉の親）とJ9707（鋸歯状の葉）の両方の遺伝的背景でCRISPR / Cas9システムを使用して誘導されました。HYバックグラウンドのBnA10.LMI1null変異は、葉のない葉を生成するのに十分でしたが、J9707バックグラウンドのnull変異は、コントロールと比較して葉の形状に明らかな変化を示しませんでした。まとめると、我々の結果は、BnA10.LMI1がセイヨウアブラナの葉葉の発達を積極的に調節し、シス調節の相違が異なる対立遺伝子効果を引き起こし、アブラナ属作物の葉葉形成の分子メカニズムへの新しい洞察を提供することを示しています。"]
[50,29216494,"plant","Camelina sativa","CRISPR;Cas9;","Fatty Acid Elongase1 (FAE1)","Plant physiology and biochemistry","Mutagenesis of the FAE1 genes significantly changes fatty acid composition in seeds of Camelina sativa.",2018,"123:1-7","[Ozseyhan ME et al.]","Montana State University, Bozeman, MT, USA.",29216494,"10.1016/j.plaphy.2017.11.021 ","Camelina sativa is a re-emerging low-input oilseed crop that has great potentials. It is necessary to ameliorate camelina oils for optimized fatty acid  composition that can meet different application requirements. Camelina seed contains significant amounts of C20-C24 very long-chain fatty acids (VLCFAs) that may not be desirable. We demonstrated that these VLCFAs can be effectively reduced by deactivating the Fatty Acid Elongase1 (FAE1) in camelina. The allohexaploid camelina contains three alleles of FAE1 genes. Ethyl methanesulfonate (EMS) induced mutation at the FAE1-B gene caused over 60% reduction of VLCFAs in seed. Homozygous knockout mutants were successfully created in a single generation by simultaneously targeting three FAE1 alleles using the CRISPR technology with an egg cell-specific Cas9 expression. VLCFAs were reduced to less than 2% of total fatty acids compared to over 22% in the wild type, and the C18 unsaturated fatty acids were concomitantly increased. The  fae1 mutants were indistinguishable from wild type in seed physiology and plant growth. This study demonstrated that the CRISPR/Cas9 technology can be effectively applied to the polyploid crop camelina to rapidly obtain desired traits such as optimal fatty acid composition in its seed oil. Knocking out FAE1  also provides a means to increase the levels of oleic acid or alpha-linolenic acid in camelina oils that are desirable for industrial or food/feed uses.","camelina sativa","Camelina sativaは、大きな可能性を秘めた、再興した低投入の油糧種子作物です。さまざまな用途の要件を満たすことができる最適化された脂肪酸組成のために、カメリナ油を改善する必要があります。Camelinaシードには、望ましくない可能性のあるC20-C24超長鎖脂肪酸（VLCFA）が大量に含まれています。これらのVLCFAは、カメリーナのFatty Acid Elongase1（FAE1）を非アクティブ化することで効果的に削減できることを示しました。同種六倍体カメリナには、FAE1遺伝子の3つの対立遺伝子が含まれています。メタンスルホン酸エチル（EMS）がFAE1-B遺伝子に突然変異を誘発すると、種子中のVLCFAが60％以上減少しました。ホモ接合型ノックアウト変異体は、卵細胞特異的なCas9発現を伴うCRISPRテクノロジーを使用して、3つのFAE1対立遺伝子を同時に標的とすることにより、単一世代で成功裏に作成されました。VLCFAは、野生型の22％以上と比較して、総脂肪酸の2％未満に減少し、同時にC18不飽和脂肪酸が増加しました。fae1変異体は、種子の生理学と植物の成長において野生型と区別がつかなかった。この研究は、CRISPR / Cas9テクノロジーを倍数体作物カメリナに効果的に適用して、種子油中の最適な脂肪酸組成などの望ましい形質を迅速に取得できることを実証しました。FAE1をノックアウトすると、工業用または食品/飼料用途に望ましいカメリナ油中のオレイン酸またはアルファ-リノレン酸のレベルを上げる手段も提供されます。"]
[51,29332168,"plant","carrot","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","flavanone-3-hydroxylase (F3H)","Plant cell reports","Efficient CRISPR/Cas9-based genome editing in carrot cells.",2018,"37(4):575-586","[Klimek-Chodacka M  et al.]","University of Agriculture in Krakow, Krakow, Poland.",29332168,"10.1007/s00299-018-2252-2 ","KEY MESSAGE: The first report presenting successful and efficient carrot genome editing using CRISPR/Cas9 system. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas9) is a powerful genome editing tool that has been widely adopted in model organisms recently, but has not been used in carrot-a model species for in vitro culture studies and an important health-promoting crop grown worldwide. In this study, for the first time, we report application of the CRISPR/Cas9 system for efficient targeted mutagenesis of the carrot genome. Multiplexing CRISPR/Cas9 vectors expressing two single-guide RNA (gRNAs) targeting the carrot flavanone-3-hydroxylase (F3H) gene  were tested for blockage of the anthocyanin biosynthesis in a model purple-colored callus using Agrobacterium-mediated genetic transformation. This approach allowed fast and visual comparison of three codon-optimized Cas9 genes and revealed that the most efficient one in generating F3H mutants was the Arabidopsis codon-optimized AteCas9 gene with up to 90% efficiency. Knockout of F3H gene resulted in the discoloration of calli, validating the functional role of this gene in the anthocyanin biosynthesis in carrot as well as providing a visual marker for screening successfully edited events. Most resulting mutations  were small Indels, but long chromosome fragment deletions of 116-119 nt were also generated with simultaneous cleavage mediated by two gRNAs. The results demonstrate successful site-directed mutagenesis in carrot with CRISPR/Cas9 and the usefulness of a model callus culture to validate genome editing systems. Given that the carrot genome has been sequenced recently, our timely study sheds  light on the promising application of genome editing tools for boosting basic and translational research in this important vegetable crop.","carrot","重要なメッセージ：CRISPR / Cas9システムを使用した成功した効率的なニンジンゲノム編集を提示する最初のレポート。Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/ CRISPR-Associated（Cas9）は、最近モデル生物で広く採用されている強力なゲノム編集ツールですが、ニンジンでは使用されていません-invitro培養研究のモデル種および世界中で栽培されている重要な健康促進作物。この研究では、初めて、ニンジンゲノムの効率的な標的突然変異誘発のためのCRISPR / Cas9システムの適用を報告します。ニンジンフラバノン-3-ヒドロキシラーゼ（F3H）遺伝子を標的とする2つのシングルガイドRNA（gRNA）を発現するマルチプレックスCRISPR / Cas9ベクターを、アグロバクテリウムを介した遺伝子形質転換を使用して、モデル紫色のカルスにおけるアントシアニン生合成の遮断についてテストしました。このアプローチにより、3つのコドン最適化Cas9遺伝子の迅速かつ視覚的な比較が可能になり、F3H変異体の生成で最も効率的なのは、最大90％の効率でArabidopsisコドン最適化AteCas9遺伝子であることが明らかになりました。F3H遺伝子のノックアウトは、カルスの変色をもたらし、ニンジンのアントシアニン生合成におけるこの遺伝子の機能的役割を検証するとともに、編集に成功したイベントをスクリーニングするための視覚的マーカーを提供しました。結果として生じた変異のほとんどは小さなインデルでしたが、116〜119 ntの長い染色体フラグメントの欠失も、2つのgRNAによって媒介される同時切断によって生成されました。結果は、CRISPR / Cas9を使用したニンジンの部位特異的突然変異誘発の成功と、ゲノム編集システムを検証するためのモデルカルス培養の有用性を示しています。ニンジンゲノムが最近配列決定されたことを考えると、私たちのタイムリーな研究は、この重要な野菜作物の基礎研究とトランスレーショナルリサーチを後押しするためのゲノム編集ツールの有望なアプリケーションに光を当てます。"]
[52,30191180,"plant","cassava","CRISPR;Cas9;","PROTEIN TARGETING TO STARCH (PTST1); GRANULE BOUND STARCH SYNTHASE (GBSS)","Science advances","Accelerated ex situ breeding of GBSS- and PTST1-edited cassava for modified starch.",2018,"4(9):eaat6086","[Bull SE  et al.]","ETH Zurich, Zurich, Switzerland.",30191180,"10.1126/sciadv.aat6086 ","Crop diversification required to meet demands for food security and industrial use is often challenged by breeding time and amenability of varieties to genome modification. Cassava is one such crop. Grown for its large starch-rich storage roots, it serves as a staple food and a commodity in the multibillion-dollar starch industry. Starch is composed of the glucose polymers amylopectin and amylose, with the latter strongly influencing the physicochemical properties of starch during cooking and processing. We demonstrate that CRISPR-Cas9 (clustered  regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)-mediated targeted mutagenesis of two genes involved in amylose biosynthesis, PROTEIN TARGETING TO STARCH (PTST1) or GRANULE BOUND STARCH SYNTHASE (GBSS), can  reduce or eliminate amylose content in root starch. Integration of the Arabidopsis FLOWERING LOCUS T gene in the genome-editing cassette allowed us to accelerate flowering-an event seldom seen under glasshouse conditions. Germinated seeds yielded S1, a transgene-free progeny that inherited edited genes. This attractive new plant breeding technique for modified cassava could be extended to other crops to provide a suite of novel varieties with useful traits for food and industrial applications.","cassava","食品の安全性と産業用途の需要を満たすために必要な作物の多様化は、繁殖時間とゲノム修飾に対する品種の快適さによってしばしば挑戦されます。Cassavaはそのような作物の1つです。でんぷんが豊富な貯蔵のルーツで育ち、数十億ドルのでんぷん業界の定番食品および商品として機能します。澱粉は、グルコースポリマーであるアミロペクチンとアミロースで構成されており、後者は調理中および加工中の澱粉の物理化学的特性に強く影響します。CRISPR-Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）を介したアミロース生合成に関与する2つの遺伝子の標的突然変異誘発、タンパク質標的化デンプン（PTST1）または顆粒結合デンプン合成酵素（GBSS）が減少できることを示しますまたはルートスターチのアミロース含有量を排除します。ゲノム編集カセットにArabidopsisFLOWERING LOCUS T遺伝子を統合することで、開花を加速することができました。これは、温室条件下ではめったに見られない出来事です。発芽した種子は、編集された遺伝子を受け継いだ導入遺伝子を含まない子孫であるS1を産出した。改変されたキャッサバのためのこの魅力的な新しい植物育種技術は、他の作物に拡張されて、食品および産業用途に有用な特性を備えた一連の新規品種を提供することができます。"]
[53,28808798,"plant","Catharansus roseus","agroinfiltration","tryptophan decarboxylase; strictosidine synthase gene","Protoplasma","Genetic engineering approach using early Vinca alkaloid biosynthesis genes led to increased tryptamine and terpenoid indole alkaloids biosynthesis in differentiating cultures of Catharanthus roseus.",2018,"255(1):425-435","[Sharma A et al.]","Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Council of Scientific and Industrial Research, Lucknow, India.",28808798,"10.1007/s00709-017-1151-7 ","Catharanthus roseus today occupies the central position in ongoing metabolic engineering efforts in medicinal plants. The entire multi-step biogenetic pathway of its very expensive anticancerous alkaloids vinblastine and vincristine is fairly very well dissected at biochemical and gene levels except the pathway steps leading to biosynthesis of monomeric alkaloid catharanthine and tabersonine. In order to enhance the plant-based productivity of these pharma molecules for the drug industry, cell and tissue cultures of C. roseus are being  increasingly tested to provide their alternate production platforms. However, a rigid developmental regulation and involvement of different cell, tissues, and organelles in the synthesis of these alkaloids have restricted the utility of these cultures. Therefore, the present study was carried out with pushing the terpenoid indole alkaloid pathway metabolic flux towards dimeric alkaloids vinblastine and vincristine production by over-expressing the two upstream pathway genes tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase at two different levels of cellular organization viz. callus and leaf tissues. The transformation experiments were carried out using Agrobacterium tumefaciens LBA1119 strain having tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase gene cassette. The callus transformation reported a maximum of 0.027% dry wt vindoline and 0.053% dry wt catharanthine production, whereas, the transiently transformed  leaves reported a maximum of 0.30% dry wt vindoline, 0.10% catharanthine, and 0.0027% dry wt vinblastine content.","Catharanthus roseus","Catharanthus roseusは今日、薬用植物で進行中の代謝工学の取り組みにおいて中心的な位置を占めています。その非常に高価な抗癌性アルカロイドであるビンブラスチンとビンクリスチンの多段階の生物遺伝学的経路全体は、単量体のアルカロイドであるカタランチンとタベルソニンの生合成につながる経路段階を除いて、生化学的および遺伝子レベルでかなりよく分析されています。製薬業界向けのこれらの製薬分子の植物ベースの生産性を高めるために、C。roseusの細胞および組織培養は、代替の生産プラットフォームを提供するためにますますテストされています。ただし、これらのアルカロイドの合成における厳格な発生規制とさまざまな細胞、組織、および細胞小器官の関与は、これらの文化の有用性を制限しています。したがって、本研究は、2つの上流経路遺伝子であるトリプトファンデカルボキシラーゼとストリクトシジンシンターゼを2つの異なるレベルの細胞組織で過剰発現させることにより、テルペノイドインドールアルカロイド経路の代謝フラックスを二量体アルカロイドであるビンブラスチンとビンクリスチンの産生に向けて推進することで実施されました。カルスと葉の組織。形質転換実験は、トリプトファンデカルボキシラーゼおよびストリクトシジンシンターゼ遺伝子カセットを有するAgrobacteriumtumefaciensLBA1119株を使用して実施された。カルス形質転換は、最大0.027％乾燥重量ビンドリンおよび0.053％乾燥重量カタランチン産生を報告したが、一時的に形質転換された葉は、最大0.30％乾燥重量ビンドリン、0.10％カタランチン、および0.0027％乾燥重量ビンブラスチン含有量を報告した。"]
[54,30034406,"plant","Catharanthus roseus","Agroinfiltration;","bifunctional geranyl(geranyl) diphosphate synthase [G(G)PPS] and geraniol synthase (GES)","Frontiers in plant science","Terpene Moiety Enhancement by Overexpression of Geranyl(geranyl) Diphosphate Synthase and Geraniol Synthase Elevates Monomeric and Dimeric Monoterpene Indole  Alkaloids in Transgenic Catharanthus roseus.",2018,"9:942","[Kumar SR et al.]","CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Bengaluru, India.",30034406,"10.3389/fpls.2018.00942 ","Catharanthus roseus is the sole source of two of the most important anticancer monoterpene indole alkaloids (MIAs), vinblastine and vincristine and their precursors, vindoline and catharanthine. The MIAs are produced from the condensation of precursors derived from indole and terpene secoiridoid pathways.  It has been previously reported that the terpene moiety limits MIA biosynthesis in C. roseus. Here, to overcome this limitation and enhance MIAs levels in C. roseus, bifunctional geranyl(geranyl) diphosphate synthase [G(G)PPS] and geraniol synthase (GES) that provide precursors for early steps of terpene moiety (secologanin) formation, were overexpressed transiently by agroinfiltration and stably by Agrobacterium-mediated transformation. Both transient and stable overexpression of G(G)PPS and co-expression of G(G)PPS+GES significantly enhanced the accumulation of secologanin, which in turn elevated the levels of monomeric MIAs. In addition, transgenic C. roseus plants exhibited increased levels of root alkaloid ajmalicine. The dimeric alkaloid vinblastine was enhanced only in G(G)PPS but not in G(G)PPS+GES transgenic lines that correlated with transcript levels of peroxidase-1 (PRX1) involved in coupling of vindoline and catharanthine into 3',4'-anhydrovinblastine, the immediate precursor of vinblastine. Moreover,  first generation (T1) lines exhibited comparable transcript and metabolite levels to that of T0 lines. In addition, transgenic lines displayed normal growth similar to wild-type plants indicating that the bifunctional G(G)PPS enhanced flux toward both primary and secondary metabolism. These results revealed that improved availability of early precursors for terpene moiety biosynthesis enhanced production of MIAs in C. roseus at the whole plant level. This is the first report demonstrating enhanced accumulation of monomeric and dimeric MIAs including root MIA ajmalicine in C. roseus through transgenic approaches.","Catharanthus roseus","Catharanthus roseusは、最も重要な2つの抗癌性モノテルペンインドールアルカロイド（MIA）であるビンブラスチンとビンクリスチン、およびそれらの前駆体であるビンドリンとカタランチンの唯一の供給源です。MIAは、インドールおよびテルペンセコイリドイド経路に由来する前駆体の凝縮から生成されます。テルペン部分がC.roseusのMIA生合成を制限することが以前に報告されています。ここでは、この制限を克服し、C。roseusのMIAレベルを高めるために、テルペン部分（セコロガニン）形成の初期段階の前駆体を提供する二官能性ゲラニル（ゲラニル）二リン酸シンターゼ[G（G）PPS]とゲラニオールシンターゼ（GES）がありました。アグロバクテリウムを介した形質転換により、アグロインフィルトレーションにより一時的に過剰発現し、安定して過剰発現します。G（G）PPSの一時的および安定した過剰発現とG（G）PPS + GESの共発現の両方が、セコロガニンの蓄積を有意に増強し、それが単量体MIAのレベルを上昇させました。さらに、トランスジェニックC. roseus植物は、根アルカロイドアジマリシンのレベルの上昇を示した。二量体アルカロイドビンブラスチンは、G（G）PPSでのみ増強され、ビンドリンとカタランチンの3 '、4'へのカップリングに関与するペルオキシダーゼ-1（PRX1）の転写レベルと相関するG（G）PPS + GESトランスジェニック系統では増強されませんでした。 -ビンブラスチンの直接の前駆体であるアンヒドロビンブラスチン。さらに、第1世代（T1）系統は、T0系統と同等の転写産物および代謝産物レベルを示しました。さらに、トランスジェニック系統は野生型植物と同様に正常な成長を示し、二機能性G（G）PPSが一次代謝と二次代謝の両方へのフラックスを増強したことを示しています。これらの結果は、テルペン部分生合成のための初期前駆体の利用可能性の改善が、植物全体レベルでのC.ロセウスにおけるMIAの産生を増強したことを明らかにした。これは、トランスジェニックアプローチを通じてC.roseusの根MIAアジマリシンを含む単量体および二量体MIAの蓄積の増強を実証する最初の報告です。"]
[55,30111865,"plant","Catharanthus roseus","CRISPR;Cas9;","receptor-like kinase 1-like (MEDOS1 to 4)","Scientific reports","Multiplex mutagenesis of four clustered CrRLK1L with CRISPR/Cas9 exposes their growth regulatory roles in response to metal ions.",2018,"8(1):12182","[Richter J  et al.]","University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU), Vienna, Austria.",30111865,"10.1038/s41598-018-30711-3 ","Resolving functions of closely linked genes is challenging or nearly impossible with classical genetic tools. Four members of the Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like (CrRLK1L) family are clustered on Arabidopsis chromosome five. To resolve the potentially redundant functions of this subclass  of CrRLK1Ls named MEDOS1 to 4 (MDS1 to 4), we generated a single CRISPR/Cas9 transformation vector using a Golden Gate based cloning system to target all four genes simultaneously. We introduce single mutations within and deletions between  MDS genes as well as knock-outs of the whole 11 kb gene cluster. The large MDS cluster deletion was inherited in up to 25% of plants lacking the CRISPR/Cas9 construct in the T2 generation. In contrast to described phenotypes of already characterized CrRLK1L mutants, quadruple mds knock-outs were fully fertile, developed normal root hairs and trichomes and responded to pharmacological inhibition of cellulose biosynthesis similar to wildtype. Recently, we demonstrated the role of four CrRLK1L in growth adaptation to metal ion stress. Here we show the involvement of MDS genes in response to Ni(2+) during hypocotyl  elongation and to Cd(2+) and Zn(2+) during root growth. Our finding supports the  model of an organ specific network of positively and negatively acting CrRLK1Ls.","Catharanthus roseus","密接に関連する遺伝子の機能を解決することは、古典的な遺伝子ツールでは困難であるか、ほぼ不可能です。Catharanthus roseus受容体様キナーゼ1様（CrRLK1L）ファミリーの4つのメンバーが、アラビドプシスの第5染色体上にクラスター化されています。MEDOS1から4（MDS1から4）という名前のCrRLK1Lのこのサブクラスの潜在的に冗長な機能を解決するために、ゴールデンゲートベースのクローニングシステムを使用して単一のCRISPR / Cas9変換ベクターを生成し、4つの遺伝子すべてを同時にターゲットにしました。MDS遺伝子内の単一の変異と欠失、および11kbの遺伝子クラスター全体のノックアウトを紹介します。大規模なMDSクラスターの削除は、T2世代のCRISPR / Cas9コンストラクトを欠く植物の最大25％で継承されました。すでに特徴付けられたCrRLK1L変異体の記述された表現型とは対照的に、4倍のmdsノックアウトは完全に繁殖力があり、正常な根毛と毛状突起を発達させ、野生型と同様にセルロース生合成の薬理学的阻害に応答しました。最近、金属イオンストレスへの成長適応における4つのCrRLK1Lの役割を示しました。ここでは、胚軸伸長中のNi（2+）と、根の成長中のCd（2+）およびZn（2+）に応答するMDS遺伝子の関与を示します。私たちの発見は、正および負に作用するCrRLK1Lの臓器特異的ネットワークのモデルをサポートしています。"]
[56,30429497,"plant","Chinese kale (Brassica oleracea var. alboglabra)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","BaPDS1; BaPDS2","Scientific reports","CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of homologous genes in Chinese kale.",2018,"8(1):16786","[Sun B et al.]","Sichuan Agricultural University, Chengdu, China.",30429497,"10.1038/s41598-018-34884-9 ","The clustered regulatory interspaced short palindromic repeat-associated protein  9 (CRISPR/Cas9) system has developed into a powerful gene-editing tool that has been successfully applied to various plant species. However, studies on the application of the CRISPR/Cas9 system to cultivated Brassica vegetables are limited. Here, we reported CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Chinese kale (Brassica oleracea var. alboglabra) for the first time. A stretch of homologous genes, namely BaPDS1 and BaPDS2, was selected as the target site. Several stable  transgenic lines with different types of mutations were generated via Agrobacterium-mediated transformation, including BaPDS1 and BaPDS2 double mutations and BaPDS1 or BaPDS2 single mutations. The overall mutation rate reached 76.47%, and these mutations involved nucleotide changes of fewer than 10  bp. The clear albino phenotype was observed in all of the mutants, including one  that harbored a mutation within an intron region, thereby indicating the importance of the intron. Cleavage in Chinese kale using CRISPR/Cas9 was biased towards AT-rich sequences. Furthermore, no off-target events were observed. Functional differences between BaPDS1 and BaPDS2 were also assessed in terms of the phenotypes of the respective mutants. In combination, these findings showed that CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis can simultaneously and efficiently modify homologous gene copies of Chinese kale and provide a convenient approach for studying gene function and improving the yield and quality of cultivated Brassica vegetables.","chinese kale","クラスター化された規制間隔の短いパリンドロームリピート関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、さまざまな植物種にうまく適用されている強力な遺伝子編集ツールに発展しました。ただし、CRISPR / Cas9システムを栽培されたアブラナ属の野菜に適用することに関する研究は限られています。ここでは、中国のケール（Brassica oleraceavar。alboglabra）でのCRISPR / Cas9を介したゲノム編集を初めて報告しました。一連の相同遺伝子、すなわちBaPDS1およびBaPDS2が標的部位として選択された。BaPDS1とBaPDS2の二重変異、BaPDS1またはBaPDS2の単一変異など、さまざまな種類の変異を持ついくつかの安定したトランスジェニック系統が、アグロバクテリウムを介した形質転換によって生成されました。全体的な突然変異率は76.47％に達し、これらの突然変異は10bp未満のヌクレオチド変化を伴いました。明確なアルビノ表現型は、イントロン領域内に変異を持っているものを含むすべての変異体で観察され、それによってイントロンの重要性を示しています。CRISPR / Cas9を使用したカイランの切断は、ATが豊富な配列に偏っていました。さらに、オフターゲットイベントは観察されませんでした。BaPDS1とBaPDS2の機能の違いも、それぞれの変異体の表現型の観点から評価されました。組み合わせて、これらの発見は、CRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発がカイランの相同遺伝子コピーを同時に効率的に改変し、遺伝子機能を研究し、栽培されたアブラナ属野菜の収量と品質を改善するための便利なアプローチを提供できることを示しました。"]
[57,30456005,"plant","coffee (Coffea arabica L.)","Agroinfiltration;","mgfp5; uidA; cry10a","3 Biotech","A simple and efficient agroinfiltration method in coffee leaves (Coffea arabica L.): assessment of factors affecting transgene expression.",2018,"8(11):471","[Vargas-Guevara C et al.]","Universidad de Costa  Rica, San Jose, Costa Rica.",30456005,"10.1007/s13205-018-1495-5 ","The establishment of a simple, rapid and efficient transient expression system is a necessary tool for the functional validation of candidate genes in coffee biotechnology. The effects of Agrobacterium strain, age of the donor plant, infiltration method, and infiltration medium on transgene expression in detached  coffee leaves were evaluated. Regarding the effect of Agrobacterium strain, the expression of uidA was higher in GV3101-treated coffee disks than in LBA4404 and  ATHV-treated samples. On the other hand, transient expression of uidA was significantly higher in leaf disks from young plants (6-weeks-old) (13.1 +/- 1.4%) than in mature tissue (12-weeks-old) (1.6 +/- 1.2%). Transient uidA expression was higher in detached coffee leaf disks from young plants infiltrated with one injection of 15 microL of Agrobacterium strain GV3101::1303 suspended in MS salts supplemented with 30 g/L sucrose, 1.9 g/L MES and 200 uM AS with subsequent sanding of the abaxial epidermis. Using the optimized protocol, expression of the uidA gene was observed 6, 24 and 48 h and 5 weeks after bacterial injection. DNA was extracted from coffee disks with positive GUS expression and specific mgfp5 and uidA fragments were amplified 5 weeks post-agroinfiltration. On the other hand, using the optimized protocol, a specific cry10Aa (500 bp) fragment was amplified in the agro-infiltrated coffee leaf disks 5 weeks post-agroinfiltration with the plasmid pB427-35S-cry10Aa. Moreover, the expression of the gene cry10Aa in two infiltrated coffee leaf disks was verified by RT-PCR and an expected 500 bp fragment was amplified.","coffee","シンプルで迅速かつ効率的な一過性発現システムの確立は、コーヒーバイオテクノロジーにおける候補遺伝子の機能検証に必要なツールです。アグロバクテリウム株、ドナー植物の年齢、浸透法、および浸透培地が、分離したコーヒーの葉における導入遺伝子の発現に及ぼす影響を評価した。アグロバクテリウム菌株の影響に関して、uidAの発現は、LBA4404およびATHVで処理されたサンプルよりもGV3101で処理されたコーヒーディスクの方が高かった。一方、uidAの一過性発現は、成熟組織（12週齢）（1.6 +/- 1.2）よりも若い植物（6週齢）（13.1 +/- 1.4％）の葉ディスクで有意に高かった。 ％）。一過性のuidA発現は、30 g / Lスクロース、1.9 g / L MES、および200 uMASを添加したMS塩に懸濁した15microLのアグロバクテリウム株GV3101 ：： 1303を1回注入し、その後に浸透させた若い植物から分離したコーヒーリーフディスクで高かった。背軸表皮のサンディング。最適化されたプロトコルを使用して、uidA遺伝子の発現は細菌注射の6、24、48時間後と5週間後に観察されました。DNAはGUS発現が陽性のコーヒーディスクから抽出され、特定のmgfp5およびuidAフラグメントがアグロインフィルトレーションの5週間後に増幅されました。一方、最適化されたプロトコルを使用して、特定のcry10Aa（500 bp）フラグメントは、プラスミドpB427-35S-cry10Aaを使用してアグロインフィルトレーションの5週間後にアグロインフィルトレーションされたコーヒーリーフディスクで増幅されました。さらに、2つの浸透したコーヒーの葉のディスクにおける遺伝子cry10Aaの発現は、RT-PCRによって検証され、予想される500bpのフラグメントが増幅されました。"]
[58,30013582,"plant","cotton","CRISPR;Cas9;","Gh14-3-3d","Frontiers in plant science","Simultaneous Editing of Two Copies of Gh14-3-3d Confers Enhanced Transgene-Clean  Plant Defense Against Verticillium dahliae in Allotetraploid Upland Cotton.",2018,"9:842","[Zhang Z et al.]","Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30013582,"10.3389/fpls.2018.00842 ","Gossypium hirsutum is an allotetraploid species, meaning that mutants that are difficult to be generated by classical approaches due to gene redundancy. The CRISPR/Cas9 genome editing system is a robust and highly efficient tool for generating target gene mutants, by which the genes of interest may be functionally dissected and applied through genotype-to-phenotype approaches. In this study, the CRISPR/Cas9 genome editing system was developed in G. hirsutum through editing the Gh14-3-3d gene. In T0 transgenic plants, lots of insertions and deletions (indels) in Gh14-3-3d at the expected target site were detected in  the allotetraploid cotton At or Dt subgenomes. The results of the PCR, T7EI digestion and sequencing analyses showed that the indels in Gh14-3-3d gene can be stably transmitted to the next generation. Additionally, the indels in the At and Dt subgenomes were segregated in the T1 transgenic plants following Mendelian law, independing on the T-DNA segregation. Two homozygous Gh14-3-3d-edited plants free of T-DNA were chosen by PCR and sequencing assays in the T1 plants, which were called transgene-clean editing plants and were designated ce1 and ce2 in the T2 lines showed higher resistance to Verticillium dahliae infestation compared to the wild-type plants. Thus, the two transgene-clean edited lines can be used as a germplasm to breed disease-resistant cotton cultivars, possibly avoiding complex  and expensive safety assessments of the transgenic plants.","cotton","Gossypium hirsutumは異質四倍体種であり、遺伝子の冗長性のために古典的なアプローチでは生成が困難な変異体を意味します。CRISPR / Cas9ゲノム編集システムは、ターゲット遺伝子変異体を生成するための堅牢で非常に効率的なツールです。これにより、対象の遺伝子を機能的に分析し、遺伝子型から表現型へのアプローチで適用できます。この研究では、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムがGh14-3-3d遺伝子の編集を通じてG.hirsutumで開発されました。T0トランスジェニック植物では、予想される標的部位でのGh14-3-3dの多くの挿入および欠失（インデル）が、異質四倍体ワタAtまたはDtサブゲノムで検出されました。PCR、T7EI消化、シーケンシング分析の結果から、Gh14-3-3d遺伝子のインデルは安定して次世代に伝達できることがわかりました。さらに、AtおよびDtサブゲノムのインデルは、T-DNA分離に依存して、メンデルの法則に従ってT1トランスジェニック植物で分離されました。T-DNAを含まない2つのホモ接合型Gh14-3-3d編集植物をT1植物でのPCRおよび配列決定アッセイによって選択しました。これらはトランスジーンクリーン編集植物と呼ばれ、T2系統でce1およびce2と指定され、Verticilliumに対してより高い耐性を示しました。野生型植物と比較したdahliaeの蔓延。したがって、2つのトランスジーンクリーン編集ラインを生殖質として使用して、耐病性のワタ栽培品種を育種することができ、トランスジェニック植物の複雑で費用のかかる安全性評価を回避できる可能性があります。"]
[59,30275376,"plant","cotton","CRISPR;Cas9;","alanine-rich protein (ALARP)","International journal of molecular sciences","Highly Efficient Targeted Gene Editing in Upland Cotton Using the CRISPR/Cas9 System.",2018,"19(10)","[Zhu S et al.]","Shihezi University, Shihezi, Xinjiang, China.",30275376,"10.3390/ijms19103000 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) gene editing system has been shown to be able to induce highly efficient mutagenesis in the targeted DNA of many plants, including cotton, and has become an important tool for investigation of gene function and crop improvement. Here, we developed a simple and easy to operate CRISPR/Cas9 system and demonstrated its high editing efficiency in cotton by targeting-ALARP, a gene encoding alanine-rich protein that is preferentially expressed in cotton fibers. Based on sequence analysis of the target site in the 10 transgenic cottons containing CRISPR/Cas9, we found that the mutation frequencies of GhALARP-A and GhALARP-D target sites were 71.4(-)100% and 92.9(-)100%, respectively. The most common editing event was deletion, but deletion together with large insertion was also observed. Mosaic mutation editing events were detected in most transgenic plants. No off-target mutation event was detected in  any the 15 predicted sites analyzed. This study provided mutants for further study of the function of GhALARP in cotton fiber development. Our results further demonstrated the feasibility of use of CRISPR/Cas9 as a targeted mutagenesis tool in cotton, and provided an efficient tool for targeted mutagenesis and functional genomics in cotton.","cotton","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）遺伝子編集システムは、綿を含む多くの植物の標的DNAに非常に効率的な突然変異誘発を誘発できることが示され、遺伝子機能と作物改良の調査。ここでは、シンプルで操作が簡単なCRISPR / Cas9システムを開発し、綿繊維で優先的に発現するアラニンに富むタンパク質をコードする遺伝子であるALARPをターゲットにして、綿での高い編集効率を実証しました。CRISPR / Cas9を含む10のトランスジェニックワタの標的部位の配列分析に基づいて、GhALARP-AおよびGhALARP-D標的部位の変異頻度はそれぞれ71.4（-）100％および92.9（-）100％であることがわかりました。 。最も一般的な編集イベントは削除でしたが、大きな挿入を伴う削除も観察されました。モザイク突然変異編集イベントは、ほとんどのトランスジェニック植物で検出されました。分析された15の予測されたサイトのいずれにおいても、オフターゲット突然変異イベントは検出されませんでした。この研究は、綿繊維の発達におけるGhALARPの機能をさらに研究するための変異体を提供しました。私たちの結果はさらに、ワタの標的突然変異誘発ツールとしてCRISPR / Cas9の使用の実現可能性を実証し、ワタの標的突然変異誘発と機能ゲノミクスのための効率的なツールを提供しました。"]
[60,28499063,"plant","cotton","CRISPR;Cas9;","Discosoma red fluorescent protein2(DsRed2); GhCLA1","Plant biotechnology journal","High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system.",2018,"16(1):137-150","[Wang P et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China.",28499063,"10.1111/pbi.12755 ","Gossypium hirsutum is an allotetraploid with a complex genome. Most genes have multiple copies that belong to At and Dt subgenomes. Sequence similarity is also  very high between gene homologues. To efficiently achieve site/gene-specific mutation is quite needed. Due to its high efficiency and robustness, the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has exerted broad site-specific genome editing from prokaryotes to eukaryotes. In this study, we utilized a CRISPR/Cas9 system to generate two sgRNAs in a single vector to conduct multiple sites genome editing in allotetraploid cotton. An exogenously transformed gene Discosoma red fluorescent protein2(DsRed2) and an endogenous gene GhCLA1 were chosen as targets. The DsRed2-edited plants in T0 generation reverted its traits to wild type, with vanished red fluorescence the whole plants. Besides, the mutated phenotype and genotype were inherited to their T1 progenies. For the endogenous gene GhCLA1, 75% of regenerated plants exhibited albino phenotype with obvious nucleotides and DNA fragments deletion. The efficiency of gene editing at each target site is 66.7-100%. The mutation genotype was checked for both genes with Sanger sequencing. Barcode-based high-throughput sequencing, which could be highly efficient for genotyping to a population of mutants, was conducted in GhCLA1-edited T0 plants and it matched well with Sanger sequencing results. No off-target editing was detected at the potential off-target sites. These results prove that the CRISPR/Cas9 system is highly efficient and reliable for allotetraploid cotton genome editing.","cotton","Gossypium hirsutumは、複雑なゲノムを持つ異質四倍体です。ほとんどの遺伝子には、AtおよびDtサブゲノムに属する複数のコピーがあります。配列類似性も遺伝子相同体間で非常に高い。部位/遺伝子特異的変異を効率的に達成するには、非常に必要です。その高い効率と堅牢性により、CRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）/ Cas9システムは、原核生物から真核生物まで幅広い部位特異的なゲノム編集を発揮しました。この研究では、CRISPR / Cas9システムを利用して、単一のベクターで2つのsgRNAを生成し、異質四倍体ワタで複数のサイトのゲノム編集を実行しました。外因的に形質転換された遺伝子Discosomared蛍光タンパク質2（DsRed2）および内因性遺伝子GhCLA1が標的として選択された。T0世代のDsRed2で編集された植物は、その形質を野生型に戻し、植物全体の赤色蛍光が消えました。その上、突然変異した表現型と遺伝子型はそれらのT1子孫に受け継がれました。内因性遺伝子GhCLA1の場合、再生された植物の75％が、明らかなヌクレオチドとDNAフラグメントの欠失を伴うアルビノ表現型を示しました。各ターゲットサイトでの遺伝子編集の効率は66.7〜100％です。突然変異の遺伝子型は、サンガーシーケンシングで両方の遺伝子についてチェックされました。変異体の集団への遺伝子型決定に非常に効率的である可能性があるバーコードベースのハイスループットシーケンスは、GhCLA1で編集されたT0植物で実施され、サンガーシーケンスの結果とよく一致しました。潜在的なオフターゲットサイトでオフターゲット編集は検出されませんでした。これらの結果は、CRISPR / Cas9システムが異質四倍体ワタゲノム編集に非常に効率的で信頼できることを証明しています。"]
[61,30305839,"plant","cotton","CRISPR;Cas9;"," ","Plant methods","Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing in cotton by improved sgRNA expression.",2018,"14:85","[Long L et al.]","Henan University, Kaifeng, Henan, China.",30305839,"10.1186/s13007-018-0353-0 ","Background: When developing CRISPR/Cas9 systems for crops, it is crucial to invest time characterizing the genome editing efficiency of the CRISPR/Cas9 cassettes, especially if the transformation system is difficult or time-consuming. Cotton is an important crop for the production of fiber, oil, and biofuel. However, the cotton stable transformation is usually performed using Agrobacterium tumefaciens taking between 8 and 12 months to generate T0 plants. Furthermore, cotton is a heterotetraploid and targeted mutagenesis is considered  to be difficult as many genes are duplicated in this complex genome. The application of CRISPR/Cas9 in cotton is severely hampered by the long and technically challenging genetic transformation process, making it imperative to maximize its efficiency. Results: In this study, we provide a new system to evaluate and validate the efficiency of CRISPR/Cas9 cassettes in cotton using a transient expression system. By using this system, we could select the most effective CRISPR/Cas9 cassettes before the stable transformation. We have also optimized the existing cotton CRISPR/Cas9 system to achieve vastly improved mutagenesis efficiency by incorporating an endogenous GhU6 promoter that increases sgRNA expression levels over the Arabidopsis AtU6-29 promoter. The 300  bp GhU6.3 promoter was cloned and validated using the transient expression system. When sgRNAs were expressed under the control of the GhU6.3 promoter in CRISPR/Cas9 cassettes, expression levels were 6-7 times higher than those provided by the AtU6-29 promoter and CRISPR/Cas9-mediated mutation efficiency was improved 4-6 times. Conclusions: This study provides essential improvements to maximize CRISPR/Cas9-mediated mutation efficiency by reducing risk and workload for the application of CRISPR/Cas9 approaches in the targeted mutagenesis of cotton.","cotton","背景：作物用のCRISPR / Cas9システムを開発する場合、特に形質転換システムが困難または時間がかかる場合は、CRISPR / Cas9カセットのゲノム編集効率を特徴付ける時間を投資することが重要です。綿花は、繊維、石油、バイオ燃料の生産にとって重要な作物です。ただし、綿の安定した形質転換は通常、Agrobacterium tumefaciensを使用して実行され、T0植物を生成するのに8〜12か月かかります。さらに、ワタはヘテロ四倍体であり、この複雑なゲノムには多くの遺伝子が複製されているため、標的突然変異誘発は困難であると考えられています。綿へのCRISPR / Cas9の適用は、長くて技術的に困難な遺伝子形質転換プロセスによってひどく妨げられており、その効率を最大化することが不可欠になっています。結果：この研究では、一過性発現システムを使用して、綿のCRISPR / Cas9カセットの効率を評価および検証するための新しいシステムを提供します。このシステムを使用することにより、安定した形質転換の前に最も効果的なCRISPR / Cas9カセットを選択することができました。また、既存の綿CRISPR / Cas9システムを最適化して、Arabidopsis AtU6-29プロモーターよりもsgRNA発現レベルを増加させる内因性GhU​​6プロモーターを組み込むことにより、大幅に改善された突然変異誘発効率を達成しました。300 bp GhU6.3プロモーターがクローン化され、一過性発現システムを使用して検証されました。sgRNAがCRISPR / Cas9カセットのGhU6.3プロモーターの制御下で発現された場合、発現レベルはAtU6-29プロモーターによって提供されるレベルより6〜7倍高く、CRISPR / Cas9を介した変異効率は4〜6倍改善されました。 。結論：この研究は、綿の標的突然変異誘発におけるCRISPR / Cas9アプローチの適用のリスクと作業負荷を減らすことにより、CRISPR / Cas9を介した突然変異効率を最大化するための本質的な改善を提供します。"]
[62,28905515,"plant","grape","CRISPR;Cas9;","VvWRKY52 transcription factor gene","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation.",2018,"16(4):844-855","[Wang X et al.]","Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China.",28905515,"10.1111/pbi.12832 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein  9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool for editing plant genomes. Efficient genome editing of grape (Vitis vinifera) suspension cells using the type II CRISPR/Cas9 system has been demonstrated; however, it has not been established whether this system can be applied to get biallelic mutations in the first generation of grape. In this current study, we designed four guide RNAs for the VvWRKY52 transcription factor gene for using with the CRISPR/Cas9 system, and obtained transgenic plants via Agrobacterium-mediated transformation, using somatic embryos of the Thompson Seedless cultivar. Analysis of the first-generation transgenic plants verified 22 mutant plants of the 72 T-DNA-inserted plants. Of these, 15 lines carried biallelic mutations and seven were heterozygous. A range of RNA-guided editing events, including large deletions, were found in the mutant plants, while smaller deletions comprised the majority of the detected mutations. Sequencing of potential off-target sites for  all four targets revealed no off-target events. In addition, knockout of VvWRKY52 in grape increased the resistance to Botrytis cinerea. We conclude that the CRISPR/Cas9 system allows precise genome editing in the first generation of grape and represents a useful tool for gene functional analysis and grape molecular breeding.","grape","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、植物ゲノムを編集するための強力なツールです。タイプIICRISPR / Cas9システムを使用したブドウ（Vitis vinifera）浮遊細胞の効率的なゲノム編集が実証されています。しかし、このシステムを適用して、第1世代のブドウの二対立遺伝子変異を取得できるかどうかは確立されていません。この現在の研究では、CRISPR / Cas9システムで使用するVvWRKY52転写因子遺伝子の4つのガイドRNAを設計し、トンプソンシードレス栽培品種の体細胞胚を使用して、アグロバクテリウムを介した形質転換によってトランスジェニック植物を取得しました。第一世代のトランスジェニック植物の分析により、72のT-DNA挿入植物のうち22の変異植物が確認されました。これらのうち、15系統は二対立遺伝子変異を持ち、7系統はヘテロ接合でした。大きな欠失を含む一連のRNA誘導編集イベントが突然変異植物で発見されたが、小さな欠失が検出された突然変異の大部分を占めていた。4つのターゲットすべての潜在的なオフターゲットサイトのシーケンスでは、オフターゲットイベントは発生しませんでした。さらに、ブドウのVvWRKY52のノックアウトは、Botrytiscinereaに対する耐性を高めました。CRISPR / Cas9システムは、第1世代のブドウで正確なゲノム編集を可能にし、遺伝子機能分析とブドウの分子育種に役立つツールであると結論付けています。"]
[63,30287957,"plant","groundcherry (Physalis pruinosa)","CRISPR;Cas9;","orthologues of tomato domestication and improvement genes that control plant architecture, flower production and fruit size","Nature plants","Rapid improvement of domestication traits in an orphan crop by genome editing.",2018,"4(10):766-770","[Lemmon ZH  et al.]","Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA.",30287957,"10.1038/s41477-018-0259-x ","Genome editing holds great promise for increasing crop productivity, and there is particular interest in advancing breeding in orphan crops, which are often burdened by undesirable characteristics resembling wild relatives. We developed genomic resources and efficient transformation in the orphan Solanaceae crop 'groundcherry' (Physalis pruinosa) and used clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) (CRISPR-Cas9) to mutate orthologues of tomato domestication and improvement genes that control plant architecture, flower production and fruit size, thereby improving these major productivity traits. Thus, translating knowledge from model crops enables rapid creation of targeted allelic diversity and novel breeding germplasm in distantly related orphan crops.","groundcherry","ゲノム編集は作物の生産性を向上させる大きな可能性を秘めており、野生の親戚に似た望ましくない特性に悩まされることが多い孤児作物の育種を進めることに特に関心があります。孤児のSolanaceae作物「groundcherry」（Physalis pruinosa）でゲノムリソースと効率的な変換を開発し、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質-9ヌクレアーゼ（Cas9）（CRISPR-Cas9）を使用して植物の構造、花の生産、果実の大きさを制御するトマトの家畜化と改善遺伝子。これにより、これらの主要な生産性特性が改善されます。したがって、モデル作物からの知識を翻訳することにより、遠縁の孤児作物において、標的とされた対立遺伝子の多様性と新しい繁殖生殖質の迅速な作成が可能になります。"]
[64,29247330,"plant","Ipomoea nil","CRISPR;Cas9;","carotenoid cleavage dioxygenase 4 (InCCD4)","Transgenic research","Alteration of flower colour in Ipomoea nil through CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of carotenoid cleavage dioxygenase 4.",2018,"27(1):25-38","[Watanabe K et al.]","University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",29247330,"10.1007/s11248-017-0051-0 ","Japanese morning glory, Ipomoea nil, exhibits a variety of flower colours, except yellow, reflecting the accumulation of only trace amounts of carotenoids in the petals. In a previous study, we attributed this effect to the low expression levels of carotenogenic genes in the petals, but there may be other contributing  factors. In the present study, we investigated the possible involvement of carotenoid cleavage dioxygenase (CCD), which cleaves specific double bonds of the polyene chains of carotenoids, in the regulation of carotenoid accumulation in the petals of I. nil. Using bioinformatics analysis, seven InCCD genes were identified in the I. nil genome. Sequencing and expression analyses indicated potential involvement of InCCD4 in carotenoid degradation in the petals. Successful knockout of InCCD4 using the CRISPR/Cas9 system in the white-flowered  cultivar I. nil cv. AK77 caused the white petals to turn pale yellow. The total amount of carotenoids in the petals of ccd4 plants was increased 20-fold relative to non-transgenic plants. This result indicates that in the petals of I. nil, not only low carotenogenic gene expression but also carotenoid degradation leads to extremely low levels of carotenoids.","Ipomoea nil","日本の朝顔、Ipomoea nilは、花びらに微量のカロテノイドが蓄積していることを反映して、黄色を除いてさまざまな花の色を示します。以前の研究では、この効果を花弁のカロテノイド生成遺伝子の発現レベルが低いことに起因すると考えましたが、他の要因がある可能性があります。本研究では、I。nilの花弁におけるカロテノイド蓄積の調節において、カロテノイドのポリエン鎖の特定の二重結合を切断するカロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（CCD）の関与の可能性を調査しました。バイオインフォマティクス分析を使用して、7つのInCCD遺伝子がI.nilゲノムで同定されました。配列決定および発現分析は、花弁におけるカロテノイド分解におけるInCCD4の潜在的な関与を示した。白い花の栽培品種I.nilcvでCRISPR / Cas9システムを使用したInCCD4のノックアウトの成功。AK77により、白い花びらが淡黄色に変わりました。ccd4植物の花弁中のカロテノイドの総量は、非トランスジェニック植物と比較して20倍増加しました。この結果は、I。nilの花弁では、カロテノイド生成遺伝子の発現が低いだけでなく、カロテノイドの分解も非常に低いレベルのカロテノイドにつながることを示しています。"]
[65,29739710,"plant","Japanese morning glory","CRISPR;Cas9;","EPHEMERAL1 (EPH1)","Plant physiology and biochemistry","CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the EPHEMERAL1 locus that regulates petal senescence in Japanese morning glory.",2018,"131:53-57","[Shibuya K et al.]","Institute of Vegetable and Floriculture Science, NARO, Tsukuba, Japan.",29739710,"10.1016/j.plaphy.2018.04.036 ","Flower longevity is one of the most important traits in ornamental plants. In Japanese morning glory (Ipomoea nil), EPHEMERAL1 (EPH1), a NAC transcription factor, is reportedly a key regulator of petal senescence. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis is a powerful tool for crop breeding as well as for biological research. Here we report the application of CRISPR/Cas9 technology to  targeted mutagenesis of the EPH1 gene in I. nil. Three regions within the EPH1 gene were simultaneously targeted by a single binary vector containing three single-guide RNA cassettes. We selected eight T0 transgenic plants containing the transferred DNA (T-DNA). Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) analysis revealed that mutations occurred at single or multiple target sites in all eight  plants. These plants harbored various mutations consisting of single base insertions and/or deletions of a single or more than two bases at the target sites. Several mutations generated at target sites were inherited in the T1 progeny with or without T-DNA insertions. Mutant plants in the T1 generations exhibited a clear delay in petal senescence. These results confirm that CRISPR/Cas9 technology can efficiently induce mutations in a target I. nil gene and that EPH1 plays a crucial role in the regulation of petal senescence. The eph1 mutants obtained in this study will be a useful tool for the elucidation of  regulatory mechanisms in petal senescence.","Japanese morning glory","花の寿命は、観賞植物の最も重要な特徴の1つです。日本の朝顔（Ipomoea nil）では、NAC転写因子であるEPHEMERAL1（EPH1）が花弁老化の重要な調節因子であると報告されています。CRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発は、作物育種や生物学的研究のための強力なツールです。ここでは、I。nilのEPH1遺伝子の標的突然変異誘発へのCRISPR / Cas9テクノロジーの適用について報告します。EPH1遺伝子内の3つの領域は、3つのシングルガイドRNAカセットを含む単一のバイナリベクターによって同時にターゲットにされました。転送されたDNA（T-DNA）を含む8つのT0トランスジェニック植物を選択しました。切断された増幅多形配列（CAPS）分析により、8つの植物すべての単一または複数の標的部位で変異が発生したことが明らかになりました。これらの植物は、標的部位での単一塩基の挿入および/または単一または3つ以上の塩基の欠失からなる様々な突然変異を抱えていた。標的部位で生成されたいくつかの変異は、T-DNA挿入の有無にかかわらずT1子孫に受け継がれました。T1世代の突然変異植物は、花弁の老化の明らかな遅延を示した。これらの結果は、CRISPR / Cas9テクノロジーがターゲットI.nil遺伝子の変異を効率的に誘発できること、およびEPH1が花弁老化の調節に重要な役割を果たすことを確認しています。この研究で得られたeph1変異体は、花弁の老化における調節メカニズムを解明するための有用なツールとなるでしょう。"]
[66,29785355,"plant","Jatropha curcas","CRISPR;Cas9;","cytochrome P450 monooxygenase, family 735, subfamily A (JcCYP735A)","PeerJ","Identification and expression analysis of cytokinin metabolic genes IPTs, CYP735A and CKXs in the biofuel plant Jatropha curcas.",2018,"6:e4812","[Cai L et al.]","Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla, Yunnan, China.",29785355,"10.7717/peerj.4812 ","The seed oil of Jatropha curcas is considered a potential bioenergy source that could replace fossil fuels. However, the seed yield of Jatropha is low and has yet to be improved. We previously reported that exogenous cytokinin treatment increased the seed yield of Jatropha. Cytokinin levels are directly regulated by  isopentenyl transferase (IPT), cytochrome P450 monooxygenase, family 735, subfamily A (CYP735A), and cytokinin oxidase/dehydrogenase (CKX). In this study,  we cloned six IPT genes, one JcCYP735A gene, and seven JcCKX genes. The expression patterns of these 14 genes in various organs were determined using real-time quantitative PCR. JcIPT1 was primarily expressed in roots and seeds, JcIPT2 was expressed in roots, apical meristems, and mature leaves, JcIPT3 was expressed in stems and mature leaves, JcIPT5 was expressed in roots and mature leaves, JcIPT6 was expressed in seeds at 10 days after pollination, and JcIPT9 was expressed in mature leaves. JcCYP735A was mainly expressed in roots, flower buds, and seeds. The seven JcCKX genes also showed different expression patterns  in different organs of Jatropha. In addition, CK levels were detected in flower buds and seeds at different stages of development. The concentration of N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)-adenine (iP), iP-riboside, and trans-zeatin (tZ) increased with flower development, and the concentration of iP decreased with seed development, while that of tZ increased. We further analyzed the function of JcCYP735A using the CRISPR-Cas9 system, and found that the concentrations of tZ and tZ-riboside decreased significantly in the Jccyp735a mutants, which showed severely retarded growth. These findings will be helpful for further studies of the functions of cytokinin metabolic genes and understanding the roles of cytokinins in Jatropha growth and development.","Jatropha curcas","Jatropha curcasの種子油は、化石燃料に取って代わる可能性のある潜在的な生物エネルギー源と考えられています。しかし、ジャトロファの種子収量は低く、まだ改善されていません。我々は以前、外因性サイトキニン処理がジャトロファの種子収量を増加させたことを報告した。サイトカイニンレベルは、イソペンテニルトランスフェラーゼ（IPT）、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、ファミリー735、サブファミリーA（CYP735A）、およびサイトカイニンオキシダーゼ/デヒドロゲナーゼ（CKX）によって直接制御されます。この研究では、6つのIPT遺伝子、1つのJcCYP735A遺伝子、および7つのJcCKX遺伝子のクローンを作成しました。さまざまな臓器におけるこれらの14の遺伝子の発現パターンは、リアルタイム定量PCRを使用して決定されました。JcIPT1は主に根と種子で発現し、JcIPT2は根、頂端メリステム、成熟葉で発現し、JcIPT3は茎と成熟葉で発現し、JcIPT5は根と成熟葉で発現し、JcIPT6は受粉後10日で種子で発現しました。 、およびJcIPT9は成熟した葉で発現しました。JcCYP735Aは主に根、花芽、種子に発現していました。7つのJcCKX遺伝子も、ジャトロファのさまざまな器官でさまざまな発現パターンを示しました。さらに、CKレベルは、発育のさまざまな段階で花芽と種子で検出されました。N（6）-（デルタ（2）-イソペンテニル）-アデニン（iP）、iP-リボシド、およびトランスゼアチン（tZ）の濃度は花の発達とともに増加し、iPの濃度は種子の発達とともに減少しました。 tZの増加。さらに、CRISPR-Cas9システムを使用してJcCYP735Aの機能を分析し、tZおよびtZ-リボシドの濃度がJccyp735a変異体で有意に減少し、成長が著しく遅延することを発見しました。これらの発見は、サイトキニン代謝遺伝子の機能のさらなる研究、およびジャトロファの成長と発達におけるサイトキニンの役割の理解に役立ちます。"]
[67,29331077,"plant","kiwifruit","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase gene (AcPDS)","Plant biotechnology journal","Optimized paired-sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high-efficiency multiplex genome editing in kiwifruit.",2018,"16(8):1424-1433","[Wang Z  et al.]","South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong, China.",29331077,"10.1111/pbi.12884 ","Kiwifruit is an important fruit crop; however, technologies for its functional genomic and molecular improvement are limited. The clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) system has been successfully applied to genetic improvement in many crops, but its editing capability is variable depending on the different combinations of the synthetic guide RNA (sgRNA) and Cas9 protein expression devices. Optimizing conditions for its use within a particular species is therefore needed to achieve highly efficient genome editing. In this study, we developed a new cloning strategy for generating paired-sgRNA/Cas9 vectors containing four sgRNAs targeting the kiwifruit phytoene desaturase gene (AcPDS). Comparing to the previous method of paired-sgRNA cloning, our strategy only requires the synthesis of two gRNA-containing primers which largely reduces the cost. We further compared efficiencies of paired-sgRNA/Cas9 vectors containing different sgRNA expression devices, including both the polycistronic tRNA-sgRNA cassette (PTG) and the traditional CRISPR expression cassette. We found the mutagenesis frequency of the PTG/Cas9 system was 10-fold higher than that of the CRISPR/Cas9  system, coinciding with the relative expressions of sgRNAs in two different expression cassettes. In particular, we identified large chromosomal fragment deletions induced by the paired-sgRNAs of the PTG/Cas9 system. Finally, as expected, we found both systems can successfully induce the albino phenotype of kiwifruit plantlets regenerated from the G418-resistance callus lines. We conclude that the PTG/Cas9 system is a more powerful system than the traditional  CRISPR/Cas9 system for kiwifruit genome editing, which provides valuable clues for optimizing CRISPR/Cas9 editing system in other plants.","kiwifruit","キウイフルーツは重要な果物作物です。ただし、その機能的なゲノムおよび分子の改善のための技術は限られています。クラスター化された調節間隔の短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質（Cas）システムは、多くの作物の遺伝的改善にうまく適用されていますが、その編集機能は、合成ガイドRNA（sgRNA）とのさまざまな組み合わせによって異なります。 Cas9タンパク質発現デバイス。したがって、特定の種内で使用するための条件を最適化することは、非常に効率的なゲノム編集を達成するために必要です。この研究では、キウイフルーツフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（AcPDS）を標的とする4つのsgRNAを含むペアsgRNA / Cas9ベクターを生成するための新しいクローニング戦略を開発しました。ペアsgRNAクローニングの以前の方法と比較して、私たちの戦略は、コストを大幅に削減する2つのgRNA含有プライマーの合成のみを必要とします。さらに、ポリシストロン性tRNA-sgRNAカセット（PTG）と従来のCRISPR発現カセットの両方を含む、異なるsgRNA発現デバイスを含むペアsgRNA / Cas9ベクターの効率を比較しました。PTG / Cas9システムの変異誘発頻度はCRISPR / Cas9システムのそれよりも10倍高く、2つの異なる発現カセットでのsgRNAの相対的な発現と一致することがわかりました。特に、PTG / Cas9システムのペアsgRNAによって誘発される大きな染色体フラグメントの欠失を特定しました。最後に、予想通り、両方のシステムが、G418耐性カルス系統から再生されたキウイフルーツ苗木のアルビノ表現型をうまく誘導できることがわかりました。PTG / Cas9システムは、他のプラントでCRISPR / Cas9編集システムを最適化するための貴重な手がかりを提供する、キウイフルーツゲノム編集用の従来のCRISPR / Cas9システムよりも強力なシステムであると結論付けています。"]
[68,29511025,"plant","lettuce (Lactuca sativa)","CRISPR;Cas9;","9-cis-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE4 (LsNCED4)","G3","High-Resolution Analysis of the Efficiency, Heritability, and Editing Outcomes of CRISPR/Cas9-Induced Modifications of NCED4 in Lettuce (Lactuca sativa).",2018,"8(5):1513-1521","[Bertier LD et al.]","University of California, Davis, CA, USA.",29511025,"10.1534/g3.117.300396 ","CRISPR/Cas9 is a transformative tool for making targeted genetic alterations. In  plants, high mutation efficiencies have been reported in primary transformants. However, many of the mutations analyzed were somatic and therefore not heritable. To provide more insights into the efficiency of creating stable homozygous mutants using CRISPR/Cas9, we targeted LsNCED4 (9-cis-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE4), a gene conditioning thermoinhibition of seed germination in lettuce. Three constructs, each capable of expressing Cas9 and a single gRNA targeting different sites in LsNCED4, were stably transformed into lettuce (Lactuca sativa) cvs. Salinas and Cobham Green. Analysis of 47 primary transformants (T1) and 368 T2 plants by deep amplicon sequencing revealed that 57% of T1 plants contained events at the target site: 28% of plants had germline  mutations in one allele indicative of an early editing event (mono-allelic), 8% of plants had germline mutations in both alleles indicative of two early editing  events (bi-allelic), and the remaining 21% of plants had multiple low frequency mutations indicative of late events (chimeric plants). Editing efficiency was similar in both genotypes, while the different gRNAs varied in efficiency. Amplicon sequencing of 20 T1 and more than 100 T2 plants for each of the three gRNAs showed that repair outcomes were not random, but reproducible and characteristic for each gRNA. Knockouts of NCED4 resulted in large increases in the maximum temperature for seed germination, with seeds of both cultivars capable of germinating >70% at 37 degrees . Knockouts of NCED4 provide a whole-plant selectable phenotype that has minimal pleiotropic consequences. Targeting NCED4 in a co-editing strategy could therefore be used to enrich for germline-edited events simply by germinating seeds at high temperature.","lettuce","CRISPR / Cas9は、標的を絞った遺伝子改変を行うための革新的なツールです。植物では、一次形質転換体で高い突然変異効率が報告されています。しかし、分析された突然変異の多くは体細胞であり、したがって遺伝性ではありませんでした。CRISPR / Cas9を使用して安定したホモ接合変異体を作成する効率についてより多くの洞察を提供するために、レタスの種子発芽の遺伝子調整熱阻害であるLsNCED4（9-cis-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE4）をターゲットにしました。それぞれCas9とLsN​​CED4の異なる部位を標的とする単一のgRNAを発現できる3つのコンストラクトは、レタス（Lactuca sativa）cvsに安定して形質転換されました。サリナスとコブハムグリーン。ディープアンプリコンシーケンシングによる47の一次形質転換体（T1）と368のT2植物の分析は、T1植物の57％が標的部位にイベントを含むことを明らかにしました：植物の28％は初期の編集イベント（単一対立遺伝子）を示す1つの対立遺伝子に生殖細胞変異を持っていました）、植物の8％は、2つの初期編集イベント（バイアレル）を示す両方の対立遺伝子に生殖細胞変異があり、残りの21％の植物は、後期イベント（キメラ植物）を示す複数の低頻度変異がありました。編集効率は両方の遺伝子型で類似していたが、異なるgRNAでは効率が異なっていた。3つのgRNAのそれぞれについて20のT1および100を超えるT2植物のアンプリコンシーケンスにより、修復結果はランダムではなく、再現性があり、各gRNAに特徴的であることが示されました。NCED4のノックアウトにより、種子発芽の最高温度が大幅に上昇し、両方の栽培品種の種子は37度で> 70％発芽することができました。NCED4のノックアウトは、多面的な影響を最小限に抑えた、植物全体で選択可能な表現型を提供します。したがって、共同編集戦略でNCED4をターゲットにすることで、高温で種子を発芽させるだけで、発芽系列で編集されたイベントを強化することができます。"]
[69,29555968,"plant","lettuce; Nicotiana benthamiana; tomato; eggplant; hot pepper; melon; orchid","Agroinfiltration;","GFP","Scientific reports","Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.",2018,"8(1):4755","[Yamamoto T et al.]","University of Tsukuba, Tsukuba, Japan.",29555968,"10.1038/s41598-018-23024-y ","An efficient and high yielding expression system is required to produce recombinant proteins. Furthermore, the transient expression system can be used to identify the localization of proteins in plant cells. In this study, we demonstrated that combination of a geminiviral replication and a double terminator dramatically enhanced the transient protein expression level in plants. The GFP protein was expressed transiently in lettuce, Nicotiana benthamiana, tomatoes, eggplants, hot peppers, melons, and orchids with agroinfiltration. Compared to a single terminator, a double terminator enhanced the expression level. A heat shock protein terminator combined with an extensin terminator resulted in the highest protein expression. Transiently expressed GFP  was confirmed by immunoblot analysis with anti-GFP antibodies. Quantitative analysis revealed that the geminiviral vector with a double terminator resulted in the expression of at least 3.7 mg/g fresh weight of GFP in Nicotiana benthamiana, approximately 2-fold that of the geminiviral vector with a single terminator. These results indicated that combination of the geminiviral replication and a double terminator is a useful tool for transient expression of  the gene of interest in plant cells.","lettuce; nicotiana benthamiana; tomato; eggplant; hot pepper; melon; orchid","組換えタンパク質を生産するには、効率的で高収量の発現システムが必要です。さらに、一過性発現システムを使用して、植物細胞におけるタンパク質の局在を特定することができます。この研究では、ジェミニウイルス複製とダブルターミネーターの組み合わせが植物における一過性タンパク質発現レベルを劇的に増強することを実証しました。GFPタンパク質は、レタス、ニコチアナベンサミアナタバコ、トマト、ナス、トウガラシ、メロン、およびアグロインフィルトレーションを伴うランで一時的に発現しました。シングルターミネーターと比較して、ダブルターミネーターは発現レベルを高めました。エクステンシンターミネーターと組み合わせた熱ショックタンパク質ターミネーターは、最高のタンパク質発現をもたらした。一過性に発現したGFPは、抗GFP抗体を用いたイムノブロット分析によって確認されました。定量分析により、ダブルターミネーターを備えたジェミニウイルスベクターは、ニコチアナベンサミアナタバコにおいて少なくとも3.7mg / gの新鮮重量のGFPの発現をもたらし、シングルターミネーターを備えたジェミニウイルスベクターの約2倍であることが明らかになった。これらの結果は、ジェミニウイルス複製とダブルターミネーターの組み合わせが、植物細胞における目的の遺伝子の一過性発現のための有用なツールであることを示した。"]
[70,30047576,"plant","Lotus japonicus","CRISPR;","C3HC4-type RING finger protein (LjCZF1)","Journal of integrative plant biology","A C3HC4-type RING finger protein regulates rhizobial infection and nodule organogenesis in Lotus japonicus.",2018,"60(9):878-896","[Cai K et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30047576,"10.1111/jipb.12703 ","During the establishment of rhizobia-legume symbiosis, the cytokinin receptor LHK1 (Lotus Histidine Kinase 1) is essential for nodule formation. However, the mechanism by which cytokinin signaling regulates symbiosis remains largely unknown. In this study, an LHK1-interacting protein, LjCZF1, was identified and further characterized. LjCZF1 is a C3HC4-type RING finger protein that is highly  conserved in plants. LjCZF1 specifically interacted with LHK1 in yeast two-hybrid, in vitro pull-down and co-immunoprecipitation assays conducted in tobacco. Phosphomimetic mutation of the potential threonine (T167D) phosphorylation site enhanced the interaction between LjCZF1 and LHK1, whereas phosphorylation mutation (T167A) eliminated this interaction. Transcript abundance of LjCZF1 was up-regulated significantly after inoculation with rhizobia. The LORE1 insertion mutant and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9-mediated knockout mutant Lotus japonicus plants demonstrated significantly reduced number of infection threads and nodules. In contrast, plants over-expressing LjCZF1 exhibited increased numbers of infection threads and nodules. Collectively, these data support the notion that LjCZF1 is a positive regulator of symbiotic nodulation, possibly through interaction with LHK1.","Lotus japonicus","リゾビア-レグメ共生の確立中、サイトキニン受容体LHK1（ロータスヒスチジンキナーゼ1）は結節形成に不可欠です。ただし、サイトカイニンシグナル伝達が共生を調節するメカニズムはほとんど知られていないままです。この研究では、LHK1と相互作用するタンパク質であるLjCZF1が同定され、さらに特徴づけられました。LjCZF1は、植物で高度に保存されているC3HC4タイプのRINGフィンガータンパク質です。LjCZF1は、タバコで実施された酵母2ハイブリッド、in vitroプルダウン、および共免疫沈降アッセイでLHK1と特異的に相互作用しました。潜在的なスレオニン（T167D）リン酸化部位のリン酸化模倣変異は、LjCZF1とLHK1の間の相互作用を強化しましたが、リン酸化変異（T167A）はこの相互作用を排除しました。LjCZF1の転写産物量は、根粒菌の接種後に有意にアップレギュレートされました。LORE1挿入変異体とクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9を介したノックアウト変異体Lotusjaponicus植物は、感染糸と結節の数が大幅に減少したことを示しました。対照的に、LjCZF1を過剰発現している植物は、感染糸と結節の数の増加を示しました。まとめると、これらのデータは、おそらくLHK1との相互作用を通じて、LjCZF1が共生結節の正の調節因子であるという概念を支持しています。"]
[71,30245698,"plant","maize","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","MS8","Frontiers in plant science","Generation of Transgene-Free Maize Male Sterile Lines Using the CRISPR/Cas9 System.",2018,"9:1180","[Chen R et al.]","Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30245698,"10.3389/fpls.2018.01180 ","Male sterility (MS) provides a useful breeding tool to harness hybrid vigor for hybrid seed production. It is necessary to generate new male sterile mutant lines for the development of hybrid seed production technology. The CRISPR/Cas9 technology is well suited for targeting genomes to generate male sterile mutants. In this study, we artificially synthesized Streptococcus pyogenes Cas9 gene with  biased codons of maize. A CRISPR/Cas9 vector targeting the MS8 gene of maize was  constructed and transformed into maize using an Agrobacterium-mediated method, and eight T0 independent transgenic lines were generated. Sequencing results showed that MS8 genes in these T0 transgenic lines were not mutated. However, we  detected mutations in the MS8 gene in F1 and F2 progenies of the transgenic line  H17. A potential off-target site sequence which had a single nucleotide that was  different from the target was also mutated in the F2 progeny of the transgenic line H17. Mutation in the MS8 gene and the male sterile phenotype could be stably inherited by the next generation in a Mendelian fashion. Transgene-free ms8 male  sterile plants were obtained by screening the F2 generation of male sterile plants, and the MS phenotype could be introduced into other elite inbred lines for hybrid production.","maize","男性不稔（MS）は、ハイブリッド種子生産のためにハイブリッド活力を利用するための有用な育種ツールを提供します。ハイブリッド種子生産技術の開発のために、新しい雄性不稔変異株を生成する必要があります。CRISPR / Cas9テクノロジーは、ゲノムをターゲットにして雄性不稔変異体を生成するのに非常に適しています。この研究では、トウモロコシの偏ったコドンを持つ化膿レンサ球菌Cas9遺伝子を人工的に合成しました。トウモロコシのMS8遺伝子を標的とするCRISPR / Cas9ベクターを構築し、アグロバクテリウムを介した方法を使用してトウモロコシに形質転換し、8つのT0独立トランスジェニック系統を作製しました。シーケンシングの結果は、これらのT0トランスジェニック系統のMS8遺伝子が変異していないことを示しました。ただし、トランスジェニック系統H17のF1およびF2子孫のMS8遺伝子に変異が検出されました。標的とは異なる単一ヌクレオチドを有する潜在的な標的外部位配列もまた、トランスジェニック系統H17のF2子孫において変異した。MS8遺伝子の変異と雄性不稔表現型は、メンデル様式で次世代に安定して受け継がれる可能性があります。導入遺伝子を含まないms8雄性不稔植物は、雄性不稔植物のF2世代をスクリーニングすることによって得られ、MS表現型はハイブリッド生産のために他のエリート近交系に導入することができた。"]
[72,29618467,"plant","maize","RdDM;"," ","G3","Subtle Perturbations of the Maize Methylome Reveal Genes and Transposons Silenced by Chromomethylase or RNA-Directed DNA Methylation Pathways.",2018,"8(6):1921-1932","[Anderson SN  et al.]","University of Minnesota, St. Paul, MN, USA.",29618467,"10.1534/g3.118.200284 ","DNA methylation is a chromatin modification that can provide epigenetic regulation of gene and transposon expression. Plants utilize several pathways to  establish and maintain DNA methylation in specific sequence contexts. The chromomethylase (CMT) genes maintain CHG (where H = A, C or T) methylation. The RNA-directed DNA methylation (RdDM) pathway is important for CHH methylation. Transcriptome analysis was performed in a collection of Zea mays lines carrying mutant alleles for CMT or RdDM-associated genes. While the majority of the transcriptome was not affected, we identified sets of genes and transposon families sensitive to context-specific decreases in DNA methylation in mutant lines. Many of the genes that are up-regulated in CMT mutant lines have high levels of CHG methylation, while genes that are differentially expressed in RdDM  mutants are enriched for having nearby mCHH islands, implicating context-specific DNA methylation in the regulation of expression for a small number of genes. Many genes regulated by CMTs exhibit natural variation for DNA methylation and transcript abundance in a panel of diverse inbred lines. Transposon families with differential expression in the mutant genotypes show few defining features, though several families up-regulated in RdDM mutants show enriched expression in  endosperm tissue, highlighting the potential importance for this pathway during reproduction. Taken together, our findings suggest that while the number of genes and transposon families whose expression is reproducibly affected by mild perturbations in context-specific methylation is small, there are distinct patterns for loci impacted by RdDM and CMT mutants.","maize","DNAメチル化は、遺伝子およびトランスポゾンの発現のエピジェネティックな調節を提供できるクロマチン修飾です。植物は、特定のシーケンスコンテキストでDNAメチル化を確立および維持するために、いくつかの経路を利用します。クロモメチラーゼ（CMT）遺伝子は、CHG（H = A、C、またはT）のメチル化を維持します。RNA指令DNAメチル化（RdDM）経路は、CHHメチル化にとって重要です。トランスクリプトーム分析は、CMTまたはRdDM関連遺伝子の変異対立遺伝子を保有するZeamays系統のコレクションで実行されました。トランスクリプトームの大部分は影響を受けませんでしたが、変異株におけるDNAメチル化の状況特異的な減少に敏感な遺伝子とトランスポゾンファミリーのセットを特定しました。CMT変異株でアップレギュレートされる遺伝子の多くは高レベルのCHGメチル化を示しますが、RdDM変異体で差次的に発現する遺伝子は、近くにmCHHアイランドがあることが豊富であり、コンテキスト固有のDNAメチル化が発現の調節に関与していることを示しています。少数の遺伝子。CMTによって調節される多くの遺伝子は、多様な近交系のパネルでDNAメチル化と転写産物の存在量に自然な変化を示します。RdDM変異体でアップレギュレートされたいくつかのファミリーは、内胚葉組織での発現が豊富であり、生殖中のこの経路の潜在的な重要性を強調していますが、変異遺伝子型で発現が異なるトランスポゾンファミリーは、明確な特徴をほとんど示しません。まとめると、我々の発見は、発現が文脈特異的メチル化の軽度の摂動によって再現可能に影響を受ける遺伝子およびトランスポゾンファミリーの数は少ないが、RdDMおよびCMT変異体によって影響を受ける遺伝子座には明確なパターンがあることを示唆している。"]
[73,28836127,"plant","maize","ODM;","non functional Green Fluorescent Protein","Journal of plant research","Relaxed chromatin induced by histone deacetylase inhibitors improves the oligonucleotide-directed gene editing in plant cells.",2018,"131(1):179-189","[Tiricz H et al.]","Institute of Plant Biology, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Hungary.",28836127,"10.1007/s10265-017-0975-8 ","Improving efficiency of oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM) is a prerequisite for wide application of this gene-editing approach in plant science  and breeding. Here we have tested histone deacetylase inhibitor treatments for induction of relaxed chromatin and for increasing the efficiency of ODM in cultured maize cells. For phenotypic assay we produced transgenic maize cell lines expressing the non-functional Green Fluorescent Protein (mGFP) gene carrying a TAG stop codon. These transgenic cells were bombarded with corrective  oligonucleotide as editing reagent to recover GFP expression. Repair of green fluorescent protein function was monitored by confocal fluorescence microscopy and flow cytometry was used for quantification of correction events. Sequencing PCR fragments of the GFP gene from corrected cells indicated a nucleotide exchange in the stop codon (TAG) from T to G nucleotide that resulted in the restoration of GFP function. We show that pretreatment of maize cells with sodium butyrate (5-10 mM) and nicotinamide (1-5 mM) as known inhibitors of histone deacetylases can cause elevated chromatin sensitivity to DNase I that was visualized in agarose gels and confirmed by the reduced presence of intact PCR template for the inserted exogenous mGFP gene. Maize cells with more relaxed chromatin could serve as an improved recipient for targeted nucleotide exchange as indicated by an average of 2.67- to 3.62-fold increase in GFP-positive cells.  Our results stimulate further studies on the role of the condition of the recipient cells in ODM and testing the application of chromatin modifying agents  in other, programmable nuclease-based genome-editing techniques in higher plants.","maize","オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発（ODM）の効率を改善することは、植物科学および育種におけるこの遺伝子編集アプローチの幅広い適用の前提条件です。ここでは、リラックスしたクロマチンの誘導と培養トウモロコシ細胞におけるODMの効率の向上のためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤処理をテストしました。表現型アッセイのために、TAG停止コドンを持つ非機能性緑色蛍光タンパク質（mGFP）遺伝子を発現するトランスジェニックトウモロコシ細胞株を作製しました。これらのトランスジェニック細胞は、GFP発現を回復するための編集試薬として修正オリゴヌクレオチドで衝撃を受けました。緑色蛍光タンパク質機能の修復は、共焦点蛍光顕微鏡法によって監視され、フローサイトメトリーが補正イベントの定量化に使用されました。修正された細胞からのGFP遺伝子のPCRフラグメントの配列決定は、GFP機能の回復をもたらしたTからGヌクレオチドへの停止コドン（TAG）のヌクレオチド交換を示した。ヒストンデアセチラーゼの既知の阻害剤としての酪酸ナトリウム（5-10 mM）およびニコチンアミド（1-5 mM）によるトウモロコシ細胞の前処理は、アガロースゲルで視覚化され、存在の減少によって確認されたDNaseIに対するクロマチン感受性の上昇を引き起こす可能性があることを示します挿入された外因性mGFP遺伝子のインタクトなPCRテンプレートの作成。クロマチンがより緩和されたトウモロコシ細胞は、GFP陽性細胞の平均2.67〜3.62倍の増加によって示されるように、標的ヌクレオチド交換の改善されたレシピエントとして役立つ可能性があります。私たちの結果は、ODMにおけるレシピエント細胞の状態の役割に関するさらなる研究を刺激し、高等植物における他のプログラム可能なヌクレアーゼベースのゲノム編集技術におけるクロマチン修飾剤の適用をテストします。"]
[74,29569825,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","dmc1 gene promoter  combined with the U3 promoter in 3 loci","Plant biotechnology journal","High-efficiency genome editing using a dmc1 promoter-controlled CRISPR/Cas9 system in maize.",2018,"16(11):1848-1857","[Feng C et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",29569825,"10.1111/pbi.12920 ","Previous studies revealed that the promoters for driving both Cas9 and sgRNAs are quite important for efficient genome editing by CRISPR/Cas9 in plants. Here, we report our results of targeted genome editing using the maize dmc1 gene promoter  combined with the U3 promoter for Cas9 and sgRNA, respectively. Three loci in the maize genome were selected for targeting. The T0 plants regenerated were highly efficiently edited at the target sites with homozygous or bi-allelic mutants accounting for about 66%. The mutations in T0 plants could be stably transmitted  to the T1 generation, and new mutations could be generated in gametes or zygotes. Whole-genome resequencing indicated that no off-target mutations could be detected in the predicted loci with sequence similarity to the targeted site. Our results show that the dmc1 promoter-controlled (DPC) CRISPR/Cas9 system is highly efficient in maize and provide further evidence that the optimization of the promoters used for the CRISPR/Cas9 system is important for enhancing the efficiency of targeted genome editing in plants. The evolutionary conservation of the dmc1 gene suggests its potential for use in other plant species.","maize","以前の研究では、Cas9とsgRNAの両方を駆動するためのプロモーターが、植物におけるCRISPR / Cas9による効率的なゲノム編集にとって非常に重要であることが明らかになりました。ここでは、それぞれCas9とsgRNAのU3プロモーターと組み合わせたトウモロコシdmc1遺伝子プロモーターを使用したターゲットゲノム編集の結果を報告します。トウモロコシゲノムの3つの遺伝子座がターゲティングのために選択されました。再生されたT0植物は、標的部位で非常に効率的に編集され、ホモ接合性またはバイアレル変異体が約66％を占めました。T0植物の突然変異は、T1世代に安定して伝達され、配偶子または接合子に新しい突然変異が生成される可能性があります。全ゲノムリシーケンシングは、標的部位と配列類似性のある予測遺伝子座で標的外変異を検出できなかったことを示しました。私たちの結果は、dmc1プロモーター制御（DPC）CRISPR / Cas9システムがトウモロコシで非常に効率的であることを示し、CRISPR / Cas9システムに使用されるプロモーターの最適化が植物の標的ゲノム編集の効率を高めるために重要であるというさらなる証拠を提供します。dmc1遺伝子の進化的保存は、他の植物種での使用の可能性を示唆しています。"]
[75,30242039,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","bZIP-type transcription factor zmbzip22","Plant cell","The ZmbZIP22 Transcription Factor Regulates 27-kD gamma-Zein Gene Transcription during Maize Endosperm Development.",2018,"30(10):2402-2424","[Li C  et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30242039,"10.1105/tpc.18.00422 ","Zeins are the most abundant storage proteins in maize (Zea mays) kernels, thereby affecting the nutritional quality and texture of this crop. 27-kD gamma-zein is highly expressed and plays a crucial role in protein body formation. Several transcription factors (TFs) (O2, PBF1, OHP1, and OHP2) regulate the expression of the 27-kD gamma-zein gene, but the complexity of its transcriptional regulation is not fully understood. Here, using probe affinity purification and mass spectrometry analysis, we identified ZmbZIP22, a TF that binds to the 27-kD gamma-zein promoter. ZmbZIP22 is a bZIP-type TF that is specifically expressed in endosperm. ZmbZIP22 bound directly to the ACAGCTCA box in the 27-kD gamma-zein promoter and activated its expression in wild tobacco (Nicotiana benthamiana) cells. 27-kD gamma-zein gene expression was significantly reduced in CRISPR/Cas9-generated zmbzip22 mutants. ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation coupled to high-throughput sequencing) confirmed that ZmbZIP22 binds to the 27-kD gamma-zein promoter in vivo and identified additional direct targets of ZmbZIP22. ZmbZIP22 can interact with PBF1, OHP1, and OHP2, but not O2. Transactivation assays using various combinations of these TFs revealed multiple interaction modes for the transcriptional activity of the 27-kD gamma-zein promoter. Therefore, ZmbZIP22 regulates 27-kD gamma-zein gene expression together with other known TFs.","maize","ゼインはトウモロコシ（Zea mays）の穀粒に最も豊富に含まれる貯蔵タンパク質であり、それによってこの作物の栄養価と食感に影響を与えます。27 kDガンマゼインは高度に発現しており、タンパク質の体形成に重要な役割を果たしています。いくつかの転写因子（TF）（O2、PBF1、OHP1、およびOHP2）は、27 kDガンマゼイン遺伝子の発現を調節しますが、その転写調節の複雑さは完全には理解されていません。ここでは、プローブアフィニティー精製と質量分析を使用して、27kDガンマゼインプロモーターに結合するTFであるZmbZIP22を特定しました。ZmbZIP22は、胚乳で特異的に発現するbZIPタイプのTFです。ZmbZIP22は、27 kDガンマゼインプロモーターのACAGCTCAボックスに直接結合し、野生タバコ（ニコチアナベンサミアナ）細胞での発現を活性化しました。27 kDガンマゼイン遺伝子発現は、CRISPR / Cas9で生成されたzmbzip22変異体で有意に減少しました。ChIP-seq（ハイスループットシーケンシングと組み合わせたクロマチン免疫沈降）により、ZmbZIP22がinvivoで27kDガンマゼインプロモーターに結合することが確認され、ZmbZIP22の追加の直接標的が特定されました。ZmbZIP22は、PBF1、OHP1、およびOHP2と相互作用できますが、O2とは相互作用できません。これらのTFのさまざまな組み合わせを使用したトランス活性化アッセイにより、27kDガンマゼインプロモーターの転写活性に対する複数の相互作用モードが明らかになりました。したがって、ZmbZIP22は、27kDのガンマゼイン遺伝子の発現を他の既知のTFと一緒に調節します。"]
[76,29967286,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","hnRNP-like glycine-rich RNA binding protein (ZmGRP1)","Plant cell","Genome-Wide Association Analyses Reveal the Importance of Alternative Splicing in Diversifying Gene Function and Regulating Phenotypic Variation in Maize.",2018,"30(7):1404-1423","[Chen Q  et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29967286,"10.1105/tpc.18.00109 ","Alternative splicing (AS) enhances transcriptome diversity and plays important roles in regulating plant processes. Although widespread natural variation in AS  has been observed in plants, how AS is regulated and contribute to phenotypic variation is poorly understood. Here, we report a population-level transcriptome  assembly and genome-wide association study to identify splicing quantitative trait loci (sQTLs) in developing maize (Zea mays) kernels from 368 inbred lines.  We detected 19,554 unique sQTLs for 6570 genes. Most sQTLs showed small isoform usage changes without involving major isoform switching between genotypes. The sQTL-affected isoforms tend to display distinct protein functions. We demonstrate that nonsense-mediated mRNA decay, microRNA-mediated regulation, and small interfering peptide-mediated peptide interference are frequently involved in sQTL regulation. The natural variation in AS and overall mRNA level appears to be independently regulated with different cis-sequences preferentially used. We identified 214 putative trans-acting splicing regulators, among which ZmGRP1, encoding an hnRNP-like glycine-rich RNA binding protein, regulates the largest trans-cluster. Knockout of ZmGRP1 by CRISPR/Cas9 altered splicing of numerous downstream genes. We found that 739 sQTLs colocalized with previous marker-trait  associations, most of which occurred without changes in overall mRNA level. Our findings uncover the importance of AS in diversifying gene function and regulating phenotypic variation.","maize","オルタナティブスプライシング（AS）は、トランスクリプトームの多様性を高め、植物プロセスの調節に重要な役割を果たします。ASの広範な自然変動が植物で観察されていますが、ASがどのように調節され、表現型の変動に寄与するかはよくわかっていません。ここでは、368の近交系からトウモロコシ（Zea mays）カーネルを開発する際のスプライシング量的形質遺伝子座（sQTL）を特定するために、集団レベルのトランスクリプトームアセンブリとゲノムワイド関連研究を報告します。6570個の遺伝子に対して19,554個の固有のsQTLが検出されました。ほとんどのsQTLは、遺伝子型間の主要なアイソフォームの切り替えを伴わずに、小さなアイソフォームの使用法の変化を示しました。sQTLの影響を受けるアイソフォームは、異なるタンパク質機能を示す傾向があります。ナンセンスを介したmRNAの減衰、microRNAを介した制御、および小さな干渉ペプチドを介したペプチドの干渉が、sQTLの制御に頻繁に関与していることを示します。ASと全体的なmRNAレベルの自然な変動は、優先的に使用されるさまざまなシスシーケンスで独立して制御されているようです。我々は214の推定トランス作用スプライシングレギュレーターを特定しました。その中で、hnRNPのようなグリシンリッチRNA結合タンパク質をコードするZmGRP1が最大のトランスクラスターを調節します。CRISPR / Cas9によるZmGRP1のノックアウトは、多数の下流遺伝子のスプライシングを変化させました。739個のsQTLが以前のマーカーと形質の関連性と共局在し、そのほとんどが全体的なmRNAレベルの変化なしに発生したことがわかりました。私たちの調査結果は、遺伝子機能の多様化と表現型の変化の調節におけるASの重要性を明らかにしています。"]
[77,29708966,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","maize heterotrimeric G protein alpha subunit COMPACT PLANT2 (CT2); eXtra Large GTP-binding proteins (XLGs)","PLoS genetics","Role of heterotrimeric Galpha proteins in maize development and enhancement of agronomic traits.",2018,"14(4):e1007374","[Wu Q  et al.]","Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA.",29708966,"10.1371/journal.pgen.1007374 ","Plant shoot systems derive from the shoot apical meristems (SAMs), pools of stems cells that are regulated by a feedback between the WUSCHEL (WUS) homeobox protein and CLAVATA (CLV) peptides and receptors. The maize heterotrimeric G protein alpha subunit COMPACT PLANT2 (CT2) functions with CLV receptors to regulate meristem development. In addition to the sole canonical Galpha CT2, maize also contains three eXtra Large GTP-binding proteins (XLGs), which have a domain with  homology to Galpha as well as additional domains. By either forcing CT2 to be constitutively active, or by depleting XLGs using CRISPR-Cas9, here we show that  both CT2 and XLGs play important roles in maize meristem regulation, and their manipulation improved agronomic traits. For example, we show that expression of a constitutively active CT2 resulted in higher spikelet density and kernel row number, larger ear inflorescence meristems (IMs) and more upright leaves, all beneficial traits selected during maize improvement. Our findings suggest that both the canonical Galpha, CT2 and the non-canonical XLGs play important roles in maize meristem regulation and further demonstrate that weak alleles of plant stem cell regulatory genes have the capacity to improve agronomic traits.","maize","植物のシュートシステムは、シュート頂端メリステム（SAM）、つまりWUSCHEL（WUS）ホメオボックスタンパク質とCLAVATA（CLV）ペプチドおよび受容体の間のフィードバックによって制御される幹細胞のプールに由来します。トウモロコシのヘテロ三量体Gタンパク質アルファサブユニットCOMPACTPLANT2（CT2）は、CLV受容体と機能してメリステムの発達を調節します。唯一の標準的なGalphaCT2に加えて、トウモロコシには3つのeXtra Large GTP結合タンパク質（XLG）も含まれています。これらは、Galphaと相同性のあるドメインと追加のドメインを持っています。CT2を構成的にアクティブにするか、CRISPR-Cas9を使用してXLGを枯渇させることにより、ここではCT2とXLGの両方がトウモロコシの分裂組織の調節に重要な役割を果たし、それらの操作によって農業特性が改善されることを示します。たとえば、構成的にアクティブなCT2の発現により、スパイクレット密度とカーネル行数が増加し、耳花序メリステム（IM）が大きくなり、直立した葉が多くなり、トウモロコシの改良中に選択されたすべての有益な特性が得られたことを示します。我々の発見は、カノニカルGalpha、CT2および非カノニカルXLGの両方がトウモロコシの分裂組織調節において重要な役割を果たしていることを示唆し、さらに植物幹細胞調節遺伝子の弱い対立遺伝子が農業形質を改善する能力を持っていることを示しています。"]
[78,29279404,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","CCT transcription factor (ZmCCT9)","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","ZmCCT9 enhances maize adaptation to higher latitudes.",2018,"115(2):E334-E341","[Huang C et al.]","China Agricultural  University, Beijing, China.",29279404,"10.1073/pnas.1718058115 ","From its tropical origin in southwestern Mexico, maize spread over a wide latitudinal cline in the Americas. This feat defies the rule that crops are inhibited from spreading easily across latitudes. How the widespread latitudinal  adaptation of maize was accomplished is largely unknown. Through positional cloning and association mapping, we resolved a flowering-time quantitative trait  locus to a Harbinger-like transposable element positioned 57 kb upstream of a CCT transcription factor (ZmCCT9). The Harbinger-like element acts in cis to repress  ZmCCT9 expression to promote flowering under long days. Knockout of ZmCCT9 by CRISPR/Cas9 causes early flowering under long days. ZmCCT9 is diurnally regulated and negatively regulates the expression of the florigen ZCN8, thereby resulting in late flowering under long days. Population genetics analyses revealed that the Harbinger-like transposon insertion at ZmCCT9 and the CACTA-like transposon insertion at another CCT paralog, ZmCCT10, arose sequentially following domestication and were targeted by selection for maize adaptation to higher latitudes. Our findings help explain how the dynamic maize genome with abundant transposon activity enabled maize to adapt over 90 degrees of latitude during the pre-Columbian era.","maize","メキシコ南西部の熱帯起源から、トウモロコシはアメリカ大陸の広い緯度の傾斜に広がりました。この偉業は、作物が緯度を越えて容易に広がることを禁じられているという規則に反しています。トウモロコシの広範な緯度適応がどのように達成されたかはほとんど知られていない。ポジショナルクローニングとアソシエーションマッピングにより、開花時期の定量的特性遺伝子座を、CCT転写因子（ZmCCT9）の57kb上流に位置するハービンガー様の転移因子に分解しました。ハービンガーのような要素はシスで作用してZmCCT9の発現を抑制し、長い日の下で開花を促進します。CRISPR / Cas9によるZmCCT9のノックアウトは、長い日数の下で早期開花を引き起こします。ZmCCT9は日中調節され、フロリゲンZCN8の発現を負に調節するため、長い日数で開花が遅くなります。集団遺伝学分析により、ZmCCT9でのHarbingerのようなトランスポゾンの挿入と、別のCCTパラログであるZmCCT10でのCACTAのようなトランスポゾンの挿入が、飼育後に順次発生し、高緯度へのトウモロコシの適応の選択の対象となったことが明らかになりました。私たちの調査結果は、豊富なトランスポゾン活性を持つ動的トウモロコシゲノムが、コロンブス以前の時代にトウモロコシが90度以上の緯度に適応することをどのように可能にしたかを説明するのに役立ちます。"]
[79,29546443,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","male sterility33 (ZmMs33)","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","Map-based cloning and characterization of Zea mays male sterility33 (ZmMs33) gene, encoding a glycerol-3-phosphate acyltransferase.",2018,"131(6):1363-1378","[Xie K et al.]","University of Science and Technology Beijing, Beijing, China.",29546443,"10.1007/s00122-018-3083-9 ","KEY MESSAGE: Map-based cloning of maize ms33 gene showed that ZmMs33 encodes a sn-2 glycerol-3-phosphate acyltransferase, the ortholog of rice OsGPAT3, and it is essential for male fertility in maize. Genetic male sterility has been widely  studied for its biological significance and commercial value in hybrid seed production. Although many male-sterile mutants have been identified in maize (Zea mays L.), it is likely that most genes that cause male sterility are unknown. Here, we report a recessive genetic male-sterile mutant, male sterility33 (ms33), which displays small, pale yellow anthers, and complete male sterility. Using a map-based cloning approach, maize GRMZM2G070304 was identified as the ms33 gene (ZmMs33). ZmMs33 encodes a novel sn-2 glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT) in maize. A functional complementation experiment showed that GRMZM2G070304 can rescue the male-sterile phenotype of the ms33-6029 mutant. GRMZM2G070304 was further confirmed to be the ms33 gene via targeted knockouts induced by the clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system.  ZmMs33 is preferentially expressed in the immature anther from the quartet to early-vacuolate microspore stages and in root tissues at the fifth leaf growth stage. Phylogenetic analysis indicated that ZmMs33 and OsGPAT3 are evolutionarily conserved for anther and pollen development in monocot species. This study reveals that the monocot-specific GPAT3 protein plays an important role in male fertility in maize, and ZmMs33 and mutants in this gene may have value in maize male-sterile line breeding and hybrid seed production.","maize","重要なメッセージ：トウモロコシms33遺伝子のマップベースのクローニングは、ZmMs33が米OsGPAT3のオルソログであるsn-2グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼをコードし、トウモロコシの男性の生殖能力に不可欠であることを示しました。遺伝的雄性不稔性は、ハイブリッド種子生産におけるその生物学的重要性と商業的価値について広く研究されてきました。トウモロコシ（Zea mays L.）では多くの雄性不稔変異体が同定されていますが、雄性不稔を引き起こすほとんどの遺伝子は不明である可能性があります。ここでは、劣性の遺伝的雄性不稔変異体である雄性不稔33（ms33）を報告します。これは、小さく淡黄色の葯と完全な雄性不稔を示します。マップベースのクローニングアプローチを使用して、トウモロコシGRMZM2G070304がms33遺伝子（ZmMs33）として識別されました。ZmMs33は、トウモロコシの新規sn-2グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）をコードします。機能補完実験は、GRMZM2G070304がms33-6029変異体の雄性不稔表現型を救うことができることを示しました。GRMZM2G070304は、クラスター化された規則的に散在する短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9システムによって誘導される標的ノックアウトを介して、ms33遺伝子であることがさらに確認されました。ZmMs33は、カルテットから初期の空胞化小胞子段階までの未成熟な葯、および第5葉成長段階の根組織で優先的に発現します。系統発生分析は、ZmMs33とOsGPAT3が単子葉植物種の葯と花粉の発達のために進化的に保存されていることを示しました。この研究は、モノコット特異的GPAT3タンパク質がトウモロコシの雄の生殖能力に重要な役割を果たしていることを明らかにしており、この遺伝子のZmMs33と変異体は、トウモロコシの雄性不稔系統の繁殖とハイブリッド種子の生産に価値がある可能性があります。"]
[80,30102384,"plant","Marchantia polymorpha","CRISPR;Cas9;","ortholog of  the METHYLTRANSFERASE 1 (MpMET)","Plant & cell physiology","Loss of CG Methylation in Marchantia polymorpha Causes Disorganization of Cell Division and Reveals Unique DNA Methylation Regulatory Mechanisms of Non-CG Methylation.",2018,"59(12):2421-2431","[Ikeda Y et al.]","Okayama University, Kurashiki, Japan.",30102384,"10.1093/pcp/pcy161 ","DNA methylation is an epigenetic mark that ensures silencing of transposable elements (TEs) and affects gene expression in many organisms. The function of different DNA methylation regulatory pathways has been largely characterized in the model plant Arabidopsis thaliana. However, far less is known about DNA methylation regulation and functions in basal land plants. Here we focus on the liverwort Marchantia polymorpha, an emerging model species that represents a basal lineage of land plants. We identified MpMET, the M. polymorpha ortholog of  the METHYLTRANSFERASE 1 (MET1) gene required for maintenance of methylation at CG sites in angiosperms. We generated Mpmet mutants using the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein9) system, which showed a significant loss of CG methylation and severe morphological changes and developmental defects. The mutants developed many adventitious shoot-like structures, suggesting that MpMET is required for maintaining differentiated cellular identities in the gametophyte. Even though numerous TEs were up-regulated, non-CG methylation was generally highly increased at TEs in the Mpmet mutants. Closer inspection of CHG methylation revealed features unique to M. polymorpha. Methylation of CCG sites in M. polymorpha does  not depend on MET1, unlike in A. thaliana and Physcomitrella patens. Our results  highlight the diversity of non-CG methylation regulatory mechanisms in plants.","Marchantia polymorpha","DNAメチル化は、転移因子（TE）のサイレンシングを保証し、多くの生物の遺伝子発現に影響を与えるエピジェネティックマークです。さまざまなDNAメチル化調節経路の機能は、モデル植物であるArabidopsisthalianaで主に特徴づけられています。しかし、基本的な陸上植物におけるDNAメチル化の調節と機能についてはほとんど知られていません。ここでは、陸生植物の基本的な系統を表す新しいモデル種である、肝虫のマルカンティアポリモルファに焦点を当てます。被子植物のCG部位でのメチル化の維持に必要なMETHYLTRANSFERASE1（MET1）遺伝子のM.polymorphaオルソログであるMpMETを同定しました。CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）システムを使用してMpmet変異体を生成しました。これは、CGメチル化の大幅な喪失と、深刻な形態変化および発達障害を示しました。変異体は多くの偶発的なシュートのような構造を発達させ、配偶体の分化した細胞のアイデンティティを維持するためにMpMETが必要であることを示唆している。多数のTEがアップレギュレートされたとしても、非CGメチル化は一般にMpmet変異体のTEで非常に増加しました。CHGメチル化を詳しく調べると、M。polymorphaに特有の特徴が明らかになりました。M. polymorphaのCCG部位のメチル化は、A。thalianaやPhyscomitrella patensとは異なり、MET1に依存しません。私たちの結果は、植物における非CGメチル化調節メカニズムの多様性を強調しています。"]
[81,30044520,"plant","Marchantia polymorpha","CRISPR;Cas9;","UV RESISTANCE LOCUS8 (UVR8)","Plant journal","UVR8-mediated induction of flavonoid biosynthesis for UVB tolerance is conserved  between the liverwort Marchantia polymorpha and flowering plants.",2018,"96(3):503-517","[Clayton WA et al.]","New Zealand Institute for Plant & Food Research Limited, Palmerston North, New Zealand.",30044520,"10.1111/tpj.14044 ","Damaging UVB radiation is a major abiotic stress facing land plants. In angiosperms the UV RESISTANCE LOCUS8 (UVR8) photoreceptor coordinates UVB responses, including inducing biosynthesis of protective flavonoids. We characterised the UVB responses of Marchantia polymorpha (marchantia), the model  species for the liverwort group of basal plants. Physiological, chemical and transcriptomic analyses were conducted on wild-type marchantia exposed to three different UVB regimes. CRISPR/Cas9 was used to obtain plant lines with mutations  for components of the UVB signal pathway or the flavonoid biosynthetic pathway, and transgenics overexpressing the marchantia UVR8 sequence were generated. The mutant and transgenic lines were analysed for changes in flavonoid content, their response to UVB exposure, and transcript abundance of a set of 48 genes that included components of the UVB response pathway characterised for angiosperms. The marchantia UVB response included many components in common with Arabidopsis,  including production of UVB-absorbing flavonoids, the central activator role of ELONGATED HYPOCOTYL5 (HY5), and negative feedback regulation by REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS1 (RUP1). Notable differences included the greater importance of CHALCONE ISOMERASE-LIKE (CHIL). Mutants disrupted in the response pathway (hy5) or flavonoid production (chalcone isomerase, chil) were more easily damaged by UVB. Mutants (rup1) or transgenics (35S:MpMYB14) with increased flavonoid content had increased UVB tolerance. The results suggest that UVR8-mediated flavonoid induction is a UVB tolerance character conserved across land plants and may have been an early adaptation to life on land.","Marchantia polymorpha","UVB放射の損傷は、陸上植物が直面する主要な非生物的ストレスです。血管精子では、UV RESISTANCE LOCUS8（UVR8）光受容体は、保護フラボノイドの生合成の誘導を含むUVB応答を調整します。基礎植物のliverwortグループのモデル種であるMarchantiapolymorpha（marchantia）のUVB応答を特徴づけました。生理学的、化学的および転写学的分析は、3つの異なるUVBレジームにさらされた野生型マーチャンティアで実施されました。CRISPR / Cas9を使用して、UVBシグナル経路またはフラボノイド生合成経路の構成要素に変異がある植物系統を取得し、マーチャンティアUVR8配列を過剰発現するトランスジェニックを生成しました。変異株とトランスジェニック系統は、フラボノイド含有量の変化、UVB曝露に対するそれらの応答、および被子植物を特徴とするUVB応答経路の構成要素を含む48遺伝子セットの転写産物量について分析されました。ゼニゴケのUVB応答には、UVB吸収フラボノイドの生成、ELONGATED HYPOCOTYL5（HY5）の中心的な活性化因子の役割、UV-B PHOTOMORPHOGENESIS1（RUP1）のリプレッサーによる負のフィードバック調節など、シロイヌナズナと共通の多くの要素が含まれていました。顕著な違いには、CHALCONE ISOMERASE-LIKE（CHIL）の重要性が高いことが含まれます。応答経路（hy5）またはフラボノイド産生（カルコンイソメラーゼ、チル）で破壊された変異体は、UVBによってより簡単に損傷を受けました。フラボノイド含有量が増加した変異体（rup1）またはトランスジェニック（35S：MpMYB14）は、UVB耐性が増加しました。結果は、UVR8を介したフラボノイド誘導が陸上植物全体で保存されているUVB耐性特性であり、陸上での生活への初期の適応であった可能性があることを示唆しています。"]
[82,30379827,"plant","Marchantia polymorpha","CRISPR;Cas9;","2 loci","PloS one","Efficient CRISPR/Cas9-based genome editing and its application to conditional genetic analysis in Marchantia polymorpha.",2018,"13(10):e0205117","[Sugano SS et al.]","Ritsumeikan University, Kusatsu, Shiga, Japan.",30379827,"10.1371/journal.pone.0205117 ","Marchantia polymorpha is one of the model species of basal land plants. Although  CRISPR/Cas9-based genome editing has already been demonstrated for this plant, the efficiency was too low to apply to functional analysis. In this study, we show the establishment of CRISPR/Cas9 genome editing vectors with high efficiency for both construction and genome editing. Codon optimization of Cas9 to Arabidopsis achieved over 70% genome editing efficiency at two loci tested. Systematic assessment revealed that guide sequences of 17 nt or shorter dramatically decreased this efficiency. We also demonstrated that a combinatorial use of this system and a floxed complementation construct enabled conditional analysis of a nearly essential gene. This study reports that simple, rapid, and efficient genome editing is feasible with the series of developed vectors.","marchantia polymorpha","ゼニゴケは、陸上植物のモデル種の1つです。CRISPR / Cas9ベースのゲノム編集はこの植物ですでに実証されていますが、効率が低すぎて機能分析に適用できませんでした。本研究では、構築とゲノム編集の両方で高効率のCRISPR / Cas9ゲノム編集ベクターの確立を示します。Cas9のArabidopsisへのコドン最適化は、テストした2つの遺伝子座で70％を超えるゲノム編集効率を達成しました。体系的な評価により、17nt以下のガイドシーケンスがこの効率を劇的に低下させることが明らかになりました。また、このシステムとfloxed補完コンストラクトを組み合わせて使用​​することで、ほぼ必須の遺伝子の条件付き分析が可能になることも実証しました。この研究は、開発された一連のベクターを使用して、単純で迅速かつ効率的なゲノム編集が可能であることを報告しています。"]
[83,29492697,"plant","Medicago sativa","CRISPR;Cas9;","squamosa promoter binding protein like 9 (SPL9)","Planta","Gene editing by CRISPR/Cas9 in the obligatory outcrossing Medicago sativa.",2018,"247(4):1043-1050","[Gao R et al.]","Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON, Canada.",29492697,"10.1007/s00425-018-2866-1 ","MAIN CONCLUSION: The CRISPR/Cas9 technique was successfully used to edit the genome of the obligatory outcrossing plant species Medicago sativa L. (alfalfa).  RNA-guided genome engineering using Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 technology enables a variety of applications in plants. Successful application and validation of the CRISPR technique in a multiplex genome, such as that of M. sativa (alfalfa) will ultimately lead to major advances in the improvement of this crop. We used CRISPR/Cas9 technique to  mutate squamosa promoter binding protein like 9 (SPL9) gene in alfalfa. Because of the complex features of the alfalfa genome, we first used droplet digital PCR  (ddPCR) for high-throughput screening of large populations of CRISPR-modified plants. Based on the results of genome editing rates obtained from the ddPCR screening, plants with relatively high rates were subjected to further analysis by restriction enzyme digestion/PCR amplification analyses. PCR products encompassing the respective small guided RNA target locus were then sub-cloned and sequenced to verify genome editing. In summary, we successfully applied the CRISPR/Cas9 technique to edit the SPL9 gene in a multiplex genome, providing some insights into opportunities to apply this technology in future alfalfa breeding.  The overall efficiency in the polyploid alfalfa genome was lower compared to other less-complex plant genomes. Further refinement of the CRISPR technology system will thus be required for more efficient genome editing in this plant.","Medicago sativa","主な結論：CRISPR / Cas9技術は、必須の異系交配植物種Medicago sativa L.（アルファルファ）のゲノムを編集するために首尾よく使用されました。Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（CRISPR）/ Cas9テクノロジーを使用したRNAガイドゲノムエンジニアリングにより、植物でのさまざまなアプリケーションが可能になります。M. sativa（alfalfa）などのマルチプレックスゲノムでのCRISPR技術の適用と検証が成功すると、最終的にはこの作物の改善に大きな進歩がもたらされます。CRISPR / Cas9技術を使用して、アルファルファの9（SPL9）遺伝子のようなスクアモサプロモーター結合タンパク質を変異させました。アルファルファゲノムの複雑な機能のため、最初に、CRISPRで修飾された植物の大集団のハイスループットスクリーニングに液滴デジタルPCR（ddPCR）を使用しました。ddPCRスクリーニングから得られたゲノム編集率の結果に基づいて、比較的高い率の植物を制限酵素消化/ PCR増幅分析に​​よるさらなる分析に供した。次に、それぞれの小さな誘導RNA標的遺伝子座を含むPCR産物をサブクローニングし、配列決定して、ゲノム編集を検証しました。要約すると、CRISPR / Cas9技術を適用して、マルチプレックスゲノムのSPL9遺伝子を編集することに成功し、将来のアルファルファ育種にこの技術を適用する機会についての洞察を提供しました。倍数体アルファルファゲノムの全体的な効率は、他のそれほど複雑でない植物ゲノムと比較して低かった。したがって、このプラントでより効率的なゲノム編集を行うには、CRISPRテクノロジーシステムをさらに改良する必要があります。"]
[84,29068239,"plant","papaya","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","extracellular cystatin-like cysteine protease inhibitor (PpalEPIC8)","Molecular plant-microbe interactions","A Phytophthora palmivora Extracellular Cystatin-Like Protease Inhibitor Targets Papain to Contribute to Virulence on Papaya.",2018,"31(3):363-373","[Gumtow R et al.]","University of Hawaii at Manoa, Honolulu, USA.",29068239,"10.1094/MPMI-06-17-0131-FI ","Papaya fruits, stems, and leaves are rich in papain, a cysteine protease that has been shown to mediate plant defense against pathogens and insects. Yet the oomycete Phytophthora palmivora is a destructive pathogen that infects all parts  of papaya plants, suggesting that it has evolved cysteine protease inhibitors to  inhibit papain to enable successful infection. Out of five putative extracellular cystatin-like cysteine protease inhibitors (PpalEPICs) from P. palmivora transcriptomic sequence data, PpalEPIC8 appeared to be unique to P. palmivora and was highly induced during infection of papaya. Purified recombinant PpalEPIC8 strongly inhibited papain enzyme activity, suggesting that it is a functional cysteine protease inhibitor. Homozygous PpalEPIC8 mutants were generated using CRISPR/Cas9-mediated gene editing via Agrobacterium-mediated transformation (AMT). Increased papain sensitivity of in-vitro growth and reduced pathogenicity  during infection of papaya fruits were observed for the mutants compared with the wild-type strain, suggesting that PpalEPIC8, indeed, plays a role in P. palmivora virulence by inhibiting papain. This study provided genetic evidence demonstrating that plant-pathogenic oomycetes secrete cystatins as important weapons to invade plants. It also established an effective gene-editing system for P. palmivora by the combined use of CRISPR/Cas9 and AMT, which is expected to be applicable to other oomycetes.","papaya","パパイヤの果物、茎、葉には、病原体や昆虫に対する植物の防御を仲介することが示されているシステインプロテアーゼであるパパインが豊富に含まれています。それでも、卵菌類Phytophthora palmivoraは、パパイヤ植物のすべての部分に感染する破壊的な病原体であり、パパインを阻害して感染を成功させるためにシステインプロテアーゼ阻害剤を進化させたことを示唆しています。P.palmivora転写配列データからの5つの推定細胞外シスタチン様システインプロテアーゼ阻害剤（PpalEPIC）のうち、PpalEPIC8はP.palmivoraに特有であるように見え、パパイヤの感染中に高度に誘導されました。精製された組換えPpalEPIC8はパパイン酵素活性を強く阻害し、機能的なシステインプロテアーゼ阻害剤であることを示唆しています。ホモ接合性のPpalEPIC8変異体は、アグロバクテリウムを介した形質転換（AMT）を介したCRISPR / Cas9を介した遺伝子編集を使用して生成されました。野生型株と比較して、変異体では、インビトロ増殖のパパイン感受性の増加およびパパイヤ果実の感染中の病原性の低下が観察され、PpalEPIC8が実際にパパインを阻害することによってP.パルミボラの毒性に役割を果たすことを示唆している。この研究は、植物病原性卵菌が植物に侵入するための重要な武器としてシスタチンを分泌することを示す遺伝的証拠を提供しました。また、CRISPR / Cas9とAMTを組み合わせて使用​​することにより、P.palmivoraの効果的な遺伝子編集システムを確立しました。これは他の卵菌にも適用できると期待されています。"]
[85,29559988,"plant","Parasopnia andersonii","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","PanHK4; PanEIN2; PanNSP1; PanNSP2","Frontiers in plant science","CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.",2018,"9:284","[van Zeijl A et al.]","Wageningen University & Research, Wageningen, Netherlands.",29559988,"10.3389/fpls.2018.00284 ","Parasponia represents five fast-growing tropical tree species in the Cannabaceae  and is the only plant lineage besides legumes that can establish nitrogen-fixing  nodules with rhizobium. Comparative analyses between legumes and Parasponia allows identification of conserved genetic networks controlling this symbiosis. However, such studies are hampered due to the absence of powerful reverse genetic tools for Parasponia. Here, we present a fast and efficient protocol for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and CRISPR/Cas9 mutagenesis of  Parasponia andersonii. Using this protocol, knockout mutants are obtained within  3 months. Due to efficient micro-propagation, bi-allelic mutants can be studied in the T0 generation, allowing phenotypic evaluation within 6 months after transformation. We mutated four genes - PanHK4, PanEIN2, PanNSP1, and PanNSP2 - that control cytokinin, ethylene, or strigolactone hormonal networks and that in  legumes commit essential symbiotic functions. Knockout mutants in Panhk4 and Panein2 displayed developmental phenotypes, namely reduced procambium activity in Panhk4 and disturbed sex differentiation in Panein2 mutants. The symbiotic phenotypes of Panhk4 and Panein2 mutant lines differ from those in legumes. In contrast, PanNSP1 and PanNSP2 are essential for nodule formation, a phenotype similar as reported for legumes. This indicates a conserved role for these GRAS-type transcriptional regulators in rhizobium symbiosis, illustrating the value of Parasponia trees as a research model for reverse genetic studies.","Parasponia andersonii","パラスポニアは、カンナバ科で急成長している5つの熱帯樹種であり、リゾビウムで窒素固定結節を確立できる、マメ科植物以外の唯一の植物系統です。マメ科植物とパラスポニアの比較分析により、この共生を制御する保存された遺伝子ネットワークの特定が可能になります。しかし、パラスポニアのための強力な逆遺伝学的ツールがないため、そのような研究は妨げられています。ここでは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換と、パラスポニア・アンダーソンイのCRISPR / Cas9変異誘発のための高速で効率的なプロトコルを紹介します。このプロトコルを使用すると、ノックアウト変異体が3か月以内に取得されます。効率的なマイクロプロパゲーションにより、バイアレリック変異体はT0世代で研究でき、形質転換後6か月以内に表現型の評価が可能になります。サイトカイニン、エチレン、またはストリゴラクトンのホルモンネットワークを制御し、マメ科植物では本質的な共生機能を果たす4つの遺伝子（PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、およびPanNSP2）を変異させました。Panhk4およびPanein2のノックアウト変異体は、発達表現型、すなわちPanhk4の前庭活動の低下、およびPanein2変異体の性分化の乱れを示しました。Panhk4およびPanein2変異株の共生表現型は、マメ科植物のものとは異なります。対照的に、PanNSP1とPanNSP2は、マメ科植物で報告されているのと同様の表現型である結節形成に不可欠です。これは、リゾビウムの共生におけるこれらのGRASタイプの転写調節因子の保存された役割を示しており、逆遺伝子研究の研究モデルとしてのパラスポニアの木の価値を示しています。"]
[86,29700675,"plant","peanut (Arachis hypogaea L.)","TALENs;","fatty acid desaturase 2","Plant molecular biology","TALEN-mediated targeted mutagenesis of fatty acid desaturase 2 (FAD2) in peanut (Arachis hypogaea L.) promotes the accumulation of oleic acid.",2018,"97(1-2):177-185","[Wen S et al.]","Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, China.",29700675,"10.1007/s11103-018-0731-z ","KEY MESSAGE: A first creation of high oleic acid peanut varieties by using transcription activator-like effecter nucleases (TALENs) mediated targeted mutagenesis of Fatty Acid Desaturase 2 (FAD2). Transcription activator like effector nucleases (TALENs), which allow the precise editing of DNA, have already been developed and applied for genome engineering in diverse organisms. However,  they are scarcely used in higher plant study and crop improvement, especially in  allopolyploid plants. In the present study, we aimed to create targeted mutagenesis by TALENs in peanut. Targeted mutations in the conserved coding sequence of Arachis hypogaea fatty acid desaturase 2 (AhFAD2) were created by TALENs. Genetic stability of AhFAD2 mutations was identified by DNA sequencing in up to 9.52 and 4.11% of the regeneration plants at two different targeted sites,  respectively. Mutation frequencies among AhFAD2 mutant lines were significantly correlated to oleic acid accumulation. Genetically, stable individuals of positive mutant lines displayed a 0.5-2 fold increase in the oleic acid content compared with non-transgenic controls. This finding suggested that TALEN-mediated targeted mutagenesis could increase the oleic acid content in edible peanut oil.  Furthermore, this was the first report on peanut genome editing event, and the obtained high oleic mutants could serve for peanut breeding project.","peanut","重要なメッセージ：転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を介した脂肪酸デサチュラーゼ2（FAD2）の標的突然変異誘発を使用した高オレイン酸ピーナッツ品種の最初の作成。DNAの正確​​な編集を可能にするエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）のような転写活性化因子は、すでに開発されており、多様な生物のゲノム工学に適用されています。しかし、それらは高等植物の研究や作物の改良、特に同種倍数体の植物ではほとんど使用されていません。本研究では、ピーナッツのTALENによる標的突然変異誘発の作成を目指しました。Arachis hypogaea脂肪酸デサチュラーゼ2（AhFAD2）の保存されたコーディング配列の標的変異は、TALENによって作成されました。AhFAD2変異の遺伝的安定性は、2つの異なる標的部位でそれぞれ最大9.52％および4.11％の再生植物でのDNA配列決定によって特定されました。AhFAD2変異株間の変異頻度は、オレイン酸の蓄積と有意に相関していた。遺伝的に、陽性変異株の安定した個体は、非トランスジェニック対照と比較して、オレイン酸含有量の0.5〜2倍の増加を示した。この発見は、TALENを介した標的突然変異誘発が食用ピーナッツオイルのオレイン酸含有量を増加させる可能性があることを示唆しました。さらに、これはピーナッツゲノム編集イベントに関する最初の報告であり、得られた高オレイン酸変異体はピーナッツ育種プロジェクトに役立つ可能性があります。"]
[87,30377238,"plant","Petunia inflata","CRISPR;Cas9;","S-Locus F-Box Protein (S2 -SLF1)","Plant cell","S-Locus F-Box Proteins Are Solely Responsible for S-RNase-Based Self-Incompatibility of Petunia Pollen.",2018,"30(12):2959-2972","[Sun L  et al.]","Pennsylvania State University, University Park, PA, USA.",30377238,"10.1105/tpc.18.00615 ","Self-incompatibility (SI) in Petunia is regulated by a polymorphic S-locus. For each S-haplotype, the S-locus contains a pistil-specific S-RNase gene and multiple pollen-specific S-locus F-box (SLF) genes. Both gain-of-function and loss-of-function experiments have shown that S-RNase alone regulates pistil specificity in SI. Gain-of-function experiments on SLF genes suggest that the entire suite of encoded proteins constitute the pollen specificity determinant. However, clear-cut loss-of-function experiments must be performed to determine if SLF proteins are essential for SI of pollen. Here, we used CRISPR/Cas9 to generate two frame-shift indel alleles of S2 -SLF1 (SLF1 of S2 -haplotype) in S2S3 plants of P. inflata and examined the effect on the SI behavior of S2 pollen. In the absence of a functional S2-SLF1, S2 pollen was either rejected by  or remained compatible with pistils carrying one of eight normally compatible S-haplotypes. All results are consistent with interaction relationships between the 17 SLF proteins of S2 -haplotype and these eight S-RNases that had been determined by gain-of-function experiments performed previously or in this work.  Our loss-of-function results provide definitive evidence that SLF proteins are solely responsible for SI of pollen, and they reveal their diverse and complex interaction relationships with S-RNases to maintain SI while ensuring cross-compatibility.","Petunia inflata","ペチュニアの自己不適合性（SI）は、多形性S遺伝子座によって調節されています。S-ハプロタイプごとに、S-locusにはピスチル固有のS-RNase遺伝子と複数の花粉固有のS-locus F-box（SLF）遺伝子が含まれています。機能獲得実験と機能喪失実験の両方で、S-RNaseのみがSIの雌しべの特異性を調節することが示されています。SLF遺伝子の機能獲得実験は、コード化されたタンパク質のスイート全体が花粉特異性決定因子を構成することを示唆しています。ただし、SLFタンパク質が花粉のSIに必須であるかどうかを判断するには、明確な機能喪失実験を実行する必要があります。ここでは、CRISPR / Cas9を使用して、P。inflataのS2S3植物でS2 -SLF1（S2ハプロタイプのSLF1）の2つのフレームシフトインデル対立遺伝子を生成し、S2花粉のSI挙動への影響を調べました。機能的なS2-SLF1がない場合、S2花粉は、8つの通常互換性のあるS-ハプロタイプの1つを運ぶピストルによって拒否されるか、互換性を維持しました。すべての結果は、S2ハプロタイプの17個のSLFタンパク質と、以前またはこの作業で実行された機能獲得実験によって決定されたこれらの8個のS-RNaseとの間の相互作用関係と一致しています。私たちの機能喪失の結果は、SLFタンパク質が花粉のSIに単独で関与しているという決定的な証拠を提供し、相互互換性を確保しながらSIを維持するためのS-RNaseとの多様で複雑な相互作用関係を明らかにします。"]
[88,29192328,"plant","Petunia inflata","CRISPR;Cas9;","PiSSK1","Plant reproduction","CRISPR/Cas9-mediated knockout of PiSSK1 reveals essential role of S-locus F-box protein-containing SCF complexes in recognition of non-self S-RNases during cross-compatible pollination in self-incompatible Petunia inflata.",2018,"31(2):129-143","[Sun L et al.]","Pennsylvania State University, University Park, PA, USA.",29192328,"10.1007/s00497-017-0314-1 ","KEY MESSAGE: Function of Petunia PiSSK1. Self-incompatibility (SI), an inbreeding-preventing mechanism, is regulated in Petunia inflata by the polymorphic S-locus, which houses multiple pollen-specific S-locus F-box (SLF) genes and a single pistil-specific S-RNase gene. S 2-haplotype and S 3-haplotype  possess the same 17 polymorphic SLF genes (named SLF1 to SLF17), and each SLF protein produced in pollen is assembled into an SCF (Skp1-Cullin1-F-box) E3 ubiquitin ligase complex. A complete suite of SLF proteins is thought to collectively interact with all non-self S-RNases to mediate their ubiquitination  and degradation by the 26S proteasome, allowing cross-compatible pollination. For each SCF(SLF) complex, the Cullin1 subunit (named PiCUL1-P) and Skp1 subunit (named PiSSK1), like the F-box protein subunits (SLFs), are pollen-specific, raising the possibility that they also evolved specifically to function in SI. Here we used CRISPR/Cas9-meditated genome editing to generate frame-shift indel mutations in PiSSK1 and examined the SI behavior of a T 0 plant (S 2 S 3) with biallelic mutations in the pollen genome and two progeny plants (S 2 S 2) each homozygous for one of the indel alleles and not carrying the Cas9-containing T-DNA. Their pollen was completely incompatible with pistils of seven otherwise-compatible S-genotypes, but fully compatible with pistils of an S 3 S 3 transgenic plant in which production of S3-RNase was completely suppressed by an  antisense S 3-RNase gene, and with pistils of immature flower buds, which produce little S-RNase. These results suggest that PiSSK1 specifically functions in SI and support the hypothesis that SLF-containing SCF complexes are essential for compatible pollination.","Petunia inflata","キーメッセージ：ペチュニアPiSSK1の機能。繁殖防止メカニズムである自己不適合性（SI）は、複数の花粉特異的S遺伝子座Fボックス（SLF）遺伝子と単一のピスチル特異的S-RNaseを収容する多形性S遺伝子座によってPetuniainflataで調節されます遺伝子。S2-ハプロタイプとS3-ハプロタイプは同じ17の多形SLF遺伝子（SLF1からSLF17と呼ばれる）を持ち、花粉で生成された各SLFタンパク質はSCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3ユビキチンリガーゼ複合体に組み立てられます。SLFタンパク質の完全なスイートは、すべての非自己S-RNaseと集合的に相互作用して、26Sプロテアソームによるユビキチン化と分解を仲介し、交差適合性のある受粉を可能にすると考えられています。各SCF（SLF）複合体について、Cullin1サブユニット（PiCUL1-Pという名前）とSkp1サブユニット（PiSSK1という名前）は、Fボックスタンパク質サブユニット（SLF）と同様に花粉特異的であり、これらも特異的に進化した可能性があります。 SIで機能します。ここでは、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を使用して、PiSSK1でフレームシフトインデル変異を生成し、花粉ゲノムと2つの子孫植物（S 2 S）に2対立遺伝子変異を伴うT 0植物（S 2 S 3）のSI挙動を調べました。 2）インデル対立遺伝子の1つについてホモ接合であり、Cas9を含むT-DNAを持たない。彼らの花粉は、他の点では互換性のある7つのS遺伝子型のピストルとは完全に互換性がありませんでしたが、S3-RNaseの生成がアンチセンスS3-RNase遺伝子によって完全に抑制されたS3 S3トランスジェニック植物のピストルとは完全に互換性がありました。 S-RNaseをほとんど生成しない未熟な花のつぼみの拳銃。これらの結果は、PiSSK1がSIで特異的に機能し、SLFを含むSCF複合体が適合性のある受粉に不可欠であるという仮説を支持することを示唆しています。"]
[89,29445053,"plant","Physcomitrella patens","CRISPR;Cas9;","SPR2","Cell structure and function","SPIRAL2 Stabilises Endoplasmic Microtubule Minus Ends in the Moss Physcomitrella  patens.",2018,"43(1):53-60","[Leong SY et al.]","Nagoya University, Japan.",29445053,"10.1247/csf.18001 ","Stabilisation of minus ends of microtubules (MTs) is critical for organising MT networks in land plant cells, in which all MTs are nucleated independent of centrosomes. Recently, Arabidopsis SPIRAL2 (SPR2) protein was shown to localise to plus and minus ends of cortical MTs, and increase stability of both ends. Here, we report molecular and functional characterisation of SPR2 of the basal land plant, the moss Physcomitrella patens. In protonemal cells of P. patens, where non-cortical, endoplasmic MT network is organised, we observed SPR2 at minus ends, but not plus ends, of endoplasmic MTs and likely also of phragmoplast MTs. Minus end decoration was reconstituted in vitro using purified SPR2, suggesting that moss SPR2 is a minus end-specific binding protein (-TIP). We generated a loss-of-function mutant of SPR2, in which frameshift-causing deletions/insertions were introduced into all four paralogous SPR2 genes by means of CRISPR/Cas9. Protonemal cells of the mutant showed instability of endoplasmic  MT minus ends. These results indicate that moss SPR2 is a MT minus end stabilising factor.Key words: acentrosomal microtubule network, microtubule minus end, P. patens, CAMSAP/Nezha/Patronin.","Physcomitrella patens","微小管（MT）のマイナス端の安定化は、すべてのMTがセントロソームとは独立して核形成される陸上植物細胞でMTネットワークを組織化するために重要です。最近、Arabidopsis SPIRAL2（SPR2）タンパク質は、皮質MTのプラス端とマイナス端に局在し、両端の安定性を高めることが示されました。ここでは、基礎陸生植物であるコケPhyscomitrellapatensのSPR2の分子的および機能的特性を報告します。非皮質の小胞体MTネットワークが組織化されているP.patensのプロトン細胞では、小胞体MTのマイナス端でSPR2が観察されましたが、プラス端では観察されませんでした。マイナス端の装飾は、精製されたSPR2を使用してin vitroで再構成され、コケSPR2がマイナス端特異的結合タンパク質（-TIP）であることを示唆しています。フレームシフトの原因となる削除/挿入がCRISPR / Cas9によって4つのパラロガスSPR2遺伝子すべてに導入された、SPR2の機能喪失変異体を生成しました。変異体のプロトネマ細胞は、小胞体MTマイナス端の不安定性を示した。これらの結果は、コケSPR2がMTマイナスエンド安定化因子であることを示しています。キーワード：アセントロソーム微小管ネットワーク、微小管マイナス端、P。patens、CAMSAP / Nezha / Patronin。"]
[90,29868058,"plant","poplar","CRISPR;Cas9;","floral meristem identity gene, LEAFY (LFY); two poplar orthologs of the floral organ identity gene AGAMOUS (AG)","Frontiers in plant science","Variation in Mutation Spectra Among CRISPR/Cas9 Mutagenized Poplars.",2018,"9:594","[Elorriaga E et al.]","Oregon State University, Corvallis, OR, USA.",29868058,"10.3389/fpls.2018.00594 ","In an effort to produce reliably contained transgenic trees, we used the CRISPR/Cas9 system to alter three genes expected to be required for normal flowering in poplar (genus Populus). We designed synthetic guide RNAs (sgRNAs) to target the poplar homolog of the floral meristem identity gene, LEAFY (LFY), and  the two poplar orthologs of the floral organ identity gene AGAMOUS (AG). We generated 557 transgenic events with sgRNA(s) and the Cas9 transgene and 49 events with Cas9 but no sgRNA, and analyzed all events by Sanger Sequencing of both alleles. Out of the 684 amplicons from events with sgRNAs, 474 had mutations in both alleles (77.5%). We sequenced both AG paralogs for 71 events in INRA clone 717-1B4 and 22 events in INRA clone 353-53, and found that 67 (94.4%) and 21 (95.5%) were double locus knockouts. Due partly to a single nucleotide polymorphism (SNP) present in the target region, one sgRNA targeting the AG paralogs was found to be completely inactive by itself (0%) but showed some activity in generating deletions when used in a construct with a second sgRNA (10.3-24.5%). Small insertion/deletion (indel) mutations were prevalent among mutated alleles of events with only one sgRNA (ranging from 94.3 to 99.1%), while large deletions were prevalent among alleles with two active sgRNAs (mean proportion of mutated alleles was 22.6% for small indels vs. 77.4% for large indels). For both LFY and AG, each individual sgRNA-gene combination had a unique mutation spectrum (p < 0.001). An AG-sgRNA construct with two sgRNAs had similar  mutation spectra among two poplar clones (p > 0.05), however, a LFY-sgRNA construct with a single sgRNA gave significantly different mutation spectra among the same two clones (p < 0.001). The 49 empty vector control events had no mutations in either allele, and 310 potential \"off-target\" sequences also had no  mutations in 58 transgenic events studied. CRISPR/Cas9 is a very powerful and precise system for generating loss-of-function mutations in poplars, and should be effective for generating reliably infertile trees that may promote regulatory, market, or public acceptance of genetic engineering technology.","Populus","確実に含まれるトランスジェニックツリーを作成するために、CRISPR / Cas9システムを使用して、ポプラ（ポプルス属）の正常な開花に必要と予想される3つの遺伝子を変更しました。花分裂組織同一性遺伝子のポプラホモログであるLEAFY（LFY）と、花器官同一性遺伝子AGAMOUS（AG）の2つのポプラオルソログを標的とする合成ガイドRNA（sgRNA）を設計しました。sgRNAとCas9トランスジーンを使用して557のトランスジェニックイベントを生成し、Cas9を使用してsgRNAを使用せずに49のイベントを生成し、両方の対立遺伝子のサンガーシーケンスによってすべてのイベントを分析しました。sgRNAのイベントからの684アンプリコンのうち、474は両方の対立遺伝子に変異がありました（77.5％）。INRAクローン717-1B4の71イベントとINRAクローン353-53の22イベントの両方のAGパラログをシーケンスし、67（94.4％）と21（95.5％）がダブルローカスノックアウトであることがわかりました。標的領域に存在する単一ヌクレオチド多型（SNP）に部分的に起因して、AGパラログを標的とする1つのsgRNAは、それ自体で完全に不活性であることがわかりました（0％）が、2番目のsgRNAを含むコンストラクトで使用すると、欠失を生成する活性を示しました。 （10.3-24.5％）。小さな挿入/削除（indel）変異は、sgRNAが1つしかないイベントの変異アレル（94.3〜99.1％の範囲）で一般的でしたが、2つのアクティブなsgRNAを持つアレルでは大きな削除が一般的でした（変異したアレルの平均比率は、小さい場合は22.6％でしたインデル対大きなインデルの77.4％）。LFYとAGの両方で、個々のsgRNA-遺伝子の組み合わせには固有の変異スペクトルがありました（p <0.001）。2つのsgRNAを含むAG-sgRNAコンストラクトは2つのポプラクローン間で同様の変異スペクトルを示しましたが（p> 0.05）、単一のsgRNAを含むLFY-sgRNAコンストラクトは同じ2つのクローン間で有意に異なる変異スペクトルを示しました（p <0.001）。49の空のベクターコントロールイベントはどちらの対立遺伝子にも変異がなく、310の潜在的な「オフターゲット」配列にも58のトランスジェニックイベントに変異がありませんでした。CRISPR / Cas9は、ポプラの機能喪失型変異を生成するための非常に強力で正確なシステムであり、遺伝子工学技術の規制、市場、または一般の受け入れを促進する可能性のある確実に不毛な樹木を生成するのに効果的です。"]
[91,30218582,"plant","poplar (Populus spp.)","CRISPR;Cas9;","JMJ25","Plant journal","Histone H3K9 demethylase JMJ25 epigenetically modulates anthocyanin biosynthesis  in poplar.",2018,"96(6):1121-1136","[Fan D et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",30218582,"10.1111/tpj.14092 ","Anthocyanins are involved in several aspects of development and defence in poplar (Populus spp.). Although, over the past decades, significant progress has been made in uncovering these anthocyanin biosynthetic and regulatory mechanisms, the  fundamental understanding of the epigenetic regulation in this pathway is still largely unclear. Here, we isolated a histone H3K9 demethylase gene JMJ25 from Populus and characterized its role in anthocyanin biosynthesis by genetic and biochemical approaches. JMJ25 was induced by continuous dark treatment. Overexpression of JMJ25 led to downregulated expression of anthocyanin biosynthetic genes in transgenic poplar, resulting in a significant reduction in  anthocyanin content. ChIP-qPCR assays showed that JMJ25 could directly associate  with MYB182 chromatin and dynamically demethylate at H3K9me2. Furthermore, JMJ25  also affected the DNA methylation levels of MYB182. By contrast, knockout of JMJ25 by CRISPR/Cas9 resulted in ectopic anthocyanin accumulation under dark condition and increased expression of anthocyanin biosynthetic genes. Our results support a model in which JMJ25 directly affects MYB182 expression by altering the histone methylation status of its chromatin and DNA methylation, resulting in repression of anthocyanin accumulation. This study uncovered an epigenetic mechanism that modulates anthocyanin biosynthesis in poplar.","Populus","アントシアニンは、ポプラ（Populus spp。）の発達と防御のいくつかの側面に関与しています。過去数十年にわたって、これらのアントシアニン生合成および調節メカニズムの解明に大きな進歩が見られましたが、この経路におけるエピジェネティックな調節の基本的な理解はまだほとんど不明です。ここでは、ポプラからヒストンH3K9デメチラーゼ遺伝子JMJ25を分離し、遺伝的および生化学的アプローチによってアントシアニン生合成におけるその役割を特徴づけました。JMJ25は継続的な暗黒処理によって誘発されました。JMJ25の過剰発現は、トランスジェニックポプラにおけるアントシアニン生合成遺伝子の発現低下をもたらし、アントシアニン含有量の有意な減少をもたらしました。ChIP-qPCRアッセイは、JMJ25がMYB182クロマチンと直接結合し、H3K9me2で動的に脱メチル化できることを示しました。さらに、JMJ25はMYB182のDNAメチル化レベルにも影響を及ぼしました。対照的に、CRISPR / Cas9によるJMJ25のノックアウトは、暗所での異所性アントシアニン蓄積とアントシアニン生合成遺伝子の発現増加をもたらしました。私たちの結果は、JMJ25がクロマチンのヒストンメチル化状態とDNAメチル化を変化させ、アントシアニン蓄積の抑制をもたらすことにより、MYB182発現に直接影響を与えるモデルを支持しています。この研究は、ポプラのアントシアニン生合成を調節するエピジェネティックなメカニズムを明らかにしました。"]
[92,30265349,"plant","Populus","CRISPR;Cas9;","BRANCHED1-1; BRANCHED2-1 candidate genes","Tree physiology","CRISPR/Cas9-mediated knockout of Populus BRANCHED1 and BRANCHED2 orthologs reveals a major function in bud outgrowth control.",2018,"38(10):1588-1597","[Muhr M et al.]","Georg-August-University, Gottingen, Germany.",30265349,"10.1093/treephys/tpy088 ","The TCP-type transcription factors BRANCHED1 and BRANCHED2 shape plant architecture by suppressing bud outgrowth, with BRANCHED2 only playing a minor role in Arabidopsis. Here, we investigated the function of orthologs of these genes in the model tree Populus. We used CRISPR/Cas9 to generate loss-of-function mutants of previously identified Populus BRANCHED1-1 and BRANCHED2-1 candidate genes. BRANCHED1-1 mutants exhibited strongly enhanced bud outgrowth. BRANCHED2-1 mutants had an extreme bud outgrowth phenotype and possessed two ectopic leaves at each node. While BRANCHED1 function is conserved in poplar, BRANCHED2, in contrast to its Arabidopsis counterpart, plays an even more critical role in bud  outgrowth regulation. In addition, we identified a new, not yet reported association of this gene to leaf development.","Populus","TCP型転写因子BRANCHED1とBRANCHED2は、芽の成長を抑制することによって植物の構造を形作り、BRANCHED2はシロイヌナズナではわずかな役割しか果たしていません。ここでは、モデルツリーポプラでこれらの遺伝子のオルソログの機能を調査しました。CRISPR / Cas9を使用して、以前に特定されたPopulusBRANCHED1-1およびBRANCHED2-1候補遺伝子の機能喪失変異体を生成しました。BRANCHED1-1変異体は、強く増強された芽の成長を示した。BRANCHED2-1変異体は、極端な芽の成長表現型を持ち、各節に2つの異所性の葉を持っていました。BRANCHED1の機能はポプラで保存されていますが、BRANCHED2は、シロイヌナズナの対応物とは対照的に、芽の成長調節においてさらに重要な役割を果たしています。さらに、この遺伝子と葉の発達との関連性については、まだ報告されていない新しいものを特定しました。"]
[93,29579304,"plant","Populus tomentosa","CRISPR;Cas9;","cytochrome P450 protein (PtoDWF4)","Tree physiology","Molecular cloning and characterization of a brassinosteriod biosynthesis-related  gene PtoDWF4 from Populus tomentosa.",2018,"38(9):1424-1436","[Shen Y et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",29579304,"10.1093/treephys/tpy027 ","Brassinosteroids (BRs) as steroid hormones play an important role in plant growth and development. However, little is known about how BRs affect secondary wall biosynthesis in woody plants. In this study, we cloned and characterized PtoDWF4, a homologus gene of Arabidopsis DWF4 encoding a cytochrome P450 protein, from Populus tomentosa. qRT-PCR analysis showed that PtoDWF4 was highly expressed in stems, especially in xylem. Overexpression of PtoDWF4 (PtoDWF4-OE) in poplar promoted growth rate and biomass yield, increased area and cell layers of xylem.  Transgenic plants showed a significant increase in plant height and stem diameter compared with the wild type. In contrast, the CRISPR/Cas9-generated mutation of PtoDWF4 (PtoDWF4-KO) resulted in significantly decreased biomass production in transgenic plants. Further studies revealed that constitutive expression of PtoDWF4 up-regulated the expression of secondary cell wall (SCW) biosynthesis-related genes, whereas knock-out of PtoDWF4 down-regulated their expression. Quantitative analysis of cell wall components showed a significant increase in PtoDWF4-OE lines but a reduction in PtoDWF4-KO lines compared with wild-type plants. Taken together, our results indicate that PtoDWF4 plays a positive role in improving growth rate and elevating biomass production in poplar.","Populus","ステロイドホルモンとしてのブラシノステロイド（BR）は、植物の成長と発達に重要な役割を果たします。しかし、BRが木質植物の二次壁生合成にどのように影響するかについてはほとんど知られていません。この研究では、Populus tomentosaから、チトクロームP450タンパク質をコードするArabidopsisDWF4の相同遺伝子であるPtoDWF4をクローン化して特性評価しました。qRT-PCR分析は、PtoDWF4が茎、特にキシレムで高度に発現していることを示しました。ポプラでのPtoDWF4（PtoDWF4-OE）の過剰発現は、成長速度とバイオマス収量を促進し、キシレムの面積と細胞層を増加させました。トランスジェニック植物は、野生型と比較して、草丈と茎の直径の有意な増加を示しました。対照的に、CRISPR / Cas9で生成されたPtoDWF4の変異（PtoDWF4-KO）は、トランスジェニック植物のバイオマス生産を大幅に減少させました。さらなる研究により、PtoDWF4の構成的発現が二次細胞壁（SCW）生合成関連遺伝子の発現をアップレギュレートしたのに対し、PtoDWF4のノックアウトはそれらの発現をダウンレギュレートしたことが明らかになりました。細胞壁成分の定量分析は、野生型植物と比較して、PtoDWF4-OE系統の有意な増加を示したが、PtoDWF4-KO系統の減少を示した。まとめると、我々の結果は、PtoDWF4がポプラの成長率の改善とバイオマス生産の向上に積極的な役割を果たしていることを示しています。"]
[94,29779105,"plant","potato","Cas9;","coilin; phytoene desaturase","Doklady. Biochemistry and biophysics","Guide RNA Design for CRISPR/Cas9-Mediated Potato Genome Editing.",2018,"479(1):90-94","[Khromov AV et al.]","OOO Doka Gene Technologies, Moscow oblast, Russia.",29779105,"10.1134/S1607672918020084 ","The activity of the pool of sgRNA molecules designed for different regions of potato coilin and phytoene desaturase genes was compared in vitro. Due to the presence of nucleotides unpaired with DNA, sgRNA is able not only to inhibit but  also to stimulate the activity of the Cas9-sgRNA complex in vitro. Although the first six nucleotides located in the DNA substrate proximally to the PAM site at  the 3' end are the binding sites for cas9, they had no significant effect on the  activity of the Cas9-sgRNA complex.","potato","ジャガイモコイリンおよびフィトエンデサチュラーゼ遺伝子の異なる領域用に設計されたsgRNA分子のプールの活性をinvitroで比較しました。DNAと対になっていないヌクレオチドが存在するため、sgRNAはinvitroでCas9-sgRNA複合体の活性を阻害するだけでなく刺激することもできます。3 '末端のPAM部位の近位にあるDNA基質にある最初の6ヌクレオチドはcas9の結合部位ですが、Cas9-sgRNA複合体の活性に有意な影響はありませんでした。"]
[95,30104651,"plant","potato","CRISPR;Cas9;","S-RNase","Nature plants","Generation of self-compatible diploid potato by knockout of S-RNase.",2018,"4(9):651-654","[Ye M et al.]","Yunnan Normal University, Kunming, China.",30104651,"10.1038/s41477-018-0218-6 ","Re-domestication of potato into an inbred line-based diploid crop propagated by seed represents a promising alternative to traditional clonal propagation of tetraploid potato, but self-incompatibility has hindered the development of inbred lines. To address this problem, we created self-compatible diploid potatoes by knocking out the self-incompatibility gene S-RNase using the CRISPR-Cas9 system. This strategy opens new avenues for diploid potato breeding and will also be useful for studying other self-incompatible crops.","potato","種子によって繁殖された同系交配ベースの二倍体作物へのジャガイモの再家畜化は、四倍体ポテトの従来のクローン増殖に対する有望な代替手段を表すが、自己不適合性が同系交配系統の発達を妨げてきた。この問題に対処するために、CRISPR-Cas9システムを使用して自己不適合遺伝子S-RNaseをノックアウトすることにより、自己適合二倍体ポテトを作成しました。この戦略は、二倍体のジャガイモ育種の新しい道を開き、他の自己不適合作物の研究にも役立ちます。"]
[96,29735370,"plant","potato","CRISPR;Cas9;","steroid 16alpha-hydroxylase (St16DOX)","Plant physiology and biochemistry","Generation of alpha-solanine-free hairy roots of potato by CRISPR/Cas9 mediated genome editing of the St16DOX gene.",2018,"131:70-77","[Nakayasu M et al.]","Kobe University, Kobe, Hyogo, Japan.",29735370,"10.1016/j.plaphy.2018.04.026 ","Potato (Solanum tuberosum) is a major food crop, while the most tissues of potato accumulates steroidal glycoalkaloids (SGAs) alpha-solanine and alpha-chaconine. Since SGAs confer a bitter taste on human and show the toxicity against various organisms, reducing the SGA content in the tubers is requisite for potato breeding. However, generation of SGA-free potato has not been achieved yet, although silencing of several SGA biosynthetic genes led a decrease in SGAs. Here, we show that the knockout of St16DOX encoding a steroid 16alpha-hydroxylase in SGA biosynthesis causes the complete abolition of the SGA accumulation in potato hairy roots. Nine candidate guide RNA (gRNA) target sequences were selected from St16DOX by in silico analysis, and the two or three gRNAs were introduced into a CRISPR/Cas9 vector designated as pMgP237-2A-GFP that can express multiplex gRNAs based on the pre-tRNA processing system. To establish rapid screening of the candidate gRNAs that can efficiently mutate the St16DOX gene, we used a potato hairy root culture system for the introduction of the pMgP237 vectors. Among the transgenic hairy roots, two independent lines showed no detectable SGAs but accumulated the glycosides of 22,26-dihydroxycholesterol,  which is the substrate of St16DOX. Analysis of the two lines with sequencing exhibited the mutated sequences of St16DOX with no wild-type sequences. Thus, generation of SGA-free hairy roots of tetraploid potato was achieved by the combination of the hairy root culture and the pMgP237-2A-GFP vector. This experimental system is useful to evaluate the efficacy of candidate gRNA target sequences in the short-term.","potato","ジャガイモ（Solanum tuberosum）は主要な食用作物ですが、ジャガイモのほとんどの組織はステロイド性グリコアルカロイド（SGA）のα-ソラニンとα-チャコニンを蓄積します。SGAは人間に苦味を与え、さまざまな生物に対して毒性を示すため、ジャガイモの育種には塊茎のSGA含有量を減らすことが必要です。ただし、いくつかのSGA生合成遺伝子のサイレンシングにより、SGAが減少したものの、SGAを含まないポテトの生成はまだ達成されていません。ここでは、SGA生合成におけるステロイド16α-ヒドロキシラーゼをコードするSt16DOXのノックアウトが、ジャガイモの毛状根におけるSGA蓄積の完全な廃止を引き起こすことを示しています。インシリコ分析によりSt16DOXから9つの候補ガイドRNA（gRNA）ターゲット配列を選択し、2つまたは3つのgRNAを、pre-tRNAに基づいてマルチプレックスgRNAを発現できるpMgP237-2A-GFPと呼ばれるCRISPR / Cas9ベクターに導入しました。処理システム。St16DOX遺伝子を効率的に変異させることができる候補gRNAの迅速なスクリーニングを確立するために、pMgP237ベクターの導入にジャガイモ毛状根培養システムを使用しました。トランスジェニック毛根の中で、2つの独立した系統は検出可能なSGAを示さなかったが、St16DOXの基質である22,26-ジヒドロキシコレステロールのグリコシドを蓄積した。シーケンシングによる2つのラインの分析では、野生型シーケンスのないSt16DOXの変異シーケンスが示されました。したがって、四倍体ジャガイモのSGAを含まない毛状根の生成は、毛状根培養とpMgP237-2A-GFPベクターの組み合わせによって達成されました。この実験システムは、候補となるgRNAターゲット配列の有効性を短期的に評価するのに役立ちます。"]
[97,30214055,"plant","potato","CRISPR;Cas9;","granule-bound starch synthase I","Scientific reports","Establishment of a modified CRISPR/Cas9 system with increased mutagenesis frequency using the translational enhancer dMac3 and multiple guide RNAs in potato.",2018,"8(1):13753","[Kusano H et al.]","Tokyo University of Science, Tokyo, Japan.",30214055,"10.1038/s41598-018-32049-2 ","CRISPR/Cas9 is a programmable nuclease composed of the Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) molecule. To create a mutant potato, a powerful genome-editing system  was required because potato has a tetraploid genome. The translational enhancer dMac3, consisting of a portion of the OsMac3 mRNA 5'-untranslated region, greatly enhanced the production of the protein encoded in the downstream ORF. To enrich the amount of Cas9, we applied the dMac3 translational enhancer to the Cas9 expression system with multiple gRNA genes. CRISPR/Cas9 systems targeting the potato granule-bound starch synthase I (GBSSI) gene examined the frequency of mutant alleles in transgenic potato plants. The efficiency of the targeted mutagenesis strongly increased when the dMac3-installed Cas9 was used. In this case, the ratio of transformants containing four mutant alleles reached approximately 25% when estimated by CAPS analysis. The mutants that exhibited targeted mutagenesis in the GBSSI gene showed characteristics of low amylose starch in their tubers. This result suggests that our system may facilitate genome-editing events in polyploid plants.","potato","CRISPR / Cas9は、Cas9タンパク質とガイドRNA（gRNA）分子で構成されるプログラム可能なヌクレアーゼです。ジャガイモは4倍体のゲノムを持っているため、変異ジャガイモを作成するには、強力なゲノム編集システムが必要でした。OsMac3 mRNA 5 '非翻訳領域の一部からなる翻訳エンハンサーdMac3は、下流のORFにコードされているタンパク質の産生を大幅に増強しました。Cas9の量を増やすために、dMac3トランスレーショナルエンハンサーを複数のgRNA遺伝子を持つCas9発現システムに適用しました。ジャガイモ顆粒結合デンプンシンターゼI（GBSSI）遺伝子を標的とするCRISPR / Cas9システムは、トランスジェニックジャガイモ植物における変異対立遺伝子の頻度を調べた。dMac3をインストールしたCas9を使用すると、標的変異誘発の効率が大幅に向上しました。この場合、CAPS分析で推定したところ、4つの変異対立遺伝子を含む形質転換体の比率は約25％に達した。GBSSI遺伝子で標的突然変異誘発を示した突然変異体は、塊茎で低アミロースデンプンの特徴を示した。この結果は、私たちのシステムが倍数体植物のゲノム編集イベントを促進する可能性があることを示唆しています。"]
[98,29572864,"plant","potato (Solanum tuberosum)","CRISPR;Cas9;","granule bound starch synthase (GBSS)","Physiologia plantarum","Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery.",2018,"164(4):378-384","[Andersson M  et al.]","Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Sweden.",29572864,"10.1111/ppl.12731 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein-9 (CRISPR-Cas9) can be used as an efficient tool for genome editing in potato (Solanum tuberosum). From both a scientific and a regulatory perspective,  it is beneficial if integration of DNA in the potato genome is avoided. We have implemented a DNA-free genome editing method, using delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins (RNPs) to potato protoplasts, by targeting the gene encoding a granule bound starch synthase (GBSS, EC 2.4.1.242). The RNP method was directly implemented using previously developed protoplast isolation, transfection and regeneration protocols without further adjustments. Cas9 protein was preassembled with RNA produced either synthetically or by in vitro transcription. RNP with synthetically produced RNA (cr-RNP) induced mutations, i.e. indels, at a frequency of up to 9%, with all mutated lines being transgene-free. A mutagenesis frequency of 25% of all regenerated shoots was found when using RNP with in vitro transcriptionally produced RNA (IVT-RNP). However, more than 80% of the shoots with confirmed mutations had unintended inserts in the cut site, which was in the same range as when using DNA delivery. The inserts originated both from DNA template remnants from the in vitro transcription, and from chromosomal potato DNA. In 2-3% of the regenerated shoots from the RNP-experiments, mutations were induced in all four alleles resulting in a complete knockout of the GBSS enzyme function.","potato (Solanum tuberosum)","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピートとCRISPR関連タンパク質-9（CRISPR-Cas9）は、ジャガイモ（Solanum tuberosum）のゲノム編集のための効率的なツールとして使用できます。科学的および規制的観点の両方から、ジャガイモゲノムへのDNAの統合が回避されれば有益です。顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSS、EC 2.4.1.242）をコードする遺伝子を標的とすることにより、CRISPR-Cas9リボヌクレオプロテイン（RNP）のジャガイモプロトプラストへの送達を使用して、DNAフリーのゲノム編集法を実装しました。RNPメソッドは、以前に開発されたプロトプラストの分離、トランスフェクション、および再生プロトコルを使用して、さらに調整することなく直接実装されました。Cas9タンパク質は、合成またはinvitro転写によって生成されたRNAで事前に組み立てられました。合成的に生成されたRNAを含むRNP（cr-RNP）は、最大9％の頻度で変異、つまりインデルを誘発し、変異した系統はすべて導入遺伝子を含まない。インビトロで転写的に生成されたRNA（IVT-RNP）とともにRNPを使用した場合、すべての再生シュートの25％の変異誘発頻度が見られました。ただし、変異が確認されたシュートの80％以上で、切断部位に意図しない挿入があり、これはDNAデリバリーを使用した場合と同じ範囲でした。インサートは、invitro転写からのDNAテンプレートの残骸と染色体ポテトDNAの両方に由来します。RNP実験から再生されたシュートの2〜3％で、4つの対立遺伝子すべてに突然変異が誘発され、GBSS酵素機能が完全にノックアウトされました。"]
[99,29577048,"plant","radish","Agroinfiltration;","staphylococcal enteroxin B","Journal of immunology research","Leaf-Encapsulated Vaccines: Agroinfiltration and Transient Expression of the Antigen Staphylococcal Endotoxin B in Radish Leaves.",2018,"2018:3710961","[Liu PF et al.]","University of California, San Diego, CA, USA.",29577048,"10.1155/2018/3710961 ","Transgene introgression is a major concern associated with transgenic plant-based vaccines. Agroinfiltration can be used to selectively transform nonreproductive organs and avoid introgression. Here, we introduce a new vaccine modality in which Staphylococcal enterotoxin B (SEB) genes are agroinfiltrated into radishes  (Raphanw sativus L.), resulting in transient expression and accumulation of SEB in planta. This approach can simultaneously express multiple antigens in a single leaf. Furthermore, the potential of high-throughput vaccine production was demonstrated by simultaneously agroinfiltrating multiple radish leaves using a multichannel pipette. The expression of SEB was detectable in two leaf cell types (epidermal and guard cells) in agroinfiltrated leaves. ICR mice intranasally immunized with homogenized leaves agroinfiltrated with SEB elicited detectable antibody to SEB and displayed protection against SEB-induced interferon-gamma (IFN-gamma) production. The concept of encapsulating antigens in leaves rather than purifying them for immunization may facilitate rapid vaccine production during an epidemic disease.","radish","導入遺伝子の遺伝子移入は、トランスジェニック植物ベースのワクチンに関連する主要な懸念事項です。アグロインフィルトレーションは、非生殖器官を選択的に形質転換し、遺伝子移入を回避するために使用できます。ここでは、ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）遺伝子が大根（Raphanw sativus L.）にアグロインフィルトレーションされ、プランタでのSEBの一時的な発現と蓄積をもたらす新しいワクチンモダリティを紹介します。このアプローチでは、1枚の葉で複数の抗原を同時に発現させることができます。さらに、マルチチャネルピペットを使用して複数の大根の葉を同時にアグロインフィルトレーションすることにより、ハイスループットワクチン生産の可能性が実証されました。SEBの発現は、アグロインフィルトレーションされた葉の2つの葉細胞タイプ（表皮細胞とガード細胞）で検出可能でした。SEBでアグロインフィルトレーションされた均質化された葉で鼻腔内免疫されたICRマウスは、SEBに対する検出可能な抗体を誘発し、SEB誘発インターフェロンガンマ（IFNガンマ）産生に対する保護を示した。免疫化のために抗原を精製するのではなく、葉に抗原をカプセル化するという概念は、流行病の間の迅速なワクチン生産を促進する可能性があります。"]
[100,30227868,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","DEP1","BMC biology","Genome sequencing of rice subspecies and genetic analysis of recombinant lines reveals regional yield- and quality-associated loci.",2018,"16(1):102","[Li X et al.]","Shenyang Agricultural University, Shenyang, China.",30227868,"10.1186/s12915-018-0572-x ","BACKGROUND: Two of the most widely cultivated rice strains are Oryza sativa indica and O. sativa japonica, and understanding the genetic basis of their agronomic traits is of importance for crop production. These two species are highly distinct in terms of geographical distribution and morphological traits. However, the relationship among genetic background, ecological conditions, and agronomic traits is unclear. RESULTS: In this study, we performed the de novo assembly of a high-quality genome of SN265, a cultivar that is extensively cultivated as a backbone japonica parent in northern China, using single-molecule sequencing. Recombinant inbred lines (RILs) derived from a cross between SN265 and R99 (indica) were re-sequenced and cultivated in three distinct ecological conditions. We identify 79 QTLs related to 15 agronomic traits. We found that several genes underwent functional alterations when the ecological conditions were changed, and some alleles exhibited contracted responses to different genetic backgrounds. We validated the involvement of one candidate gene, DEP1, in determining panicle length, using CRISPR/Cas9 gene editing. CONCLUSIONS: This study provides information on the suitable environmental conditions, and genetic  background, for functional genes in rice breeding. Moreover, the public availability of the reference genome of northern japonica SN265 provides a valuable resource for plant biologists and the genetic improvement of crops.","rice","背景：最も広く栽培されている米株の2つはOryza sativaindicaとO.sativa japonicaであり、それらの農業特性の遺伝的基礎を理解することは作物生産にとって重要です。これらの2つの種は、地理的分布と形態的特徴の点で非常に異なっています。ただし、遺伝的背景、生態学的条件、および農業形質の間の関係は不明です。結果：この研究では、単一分子シーケンスを使用して、中国北部でバックボーンジャポニカの親として広く栽培されている品種であるSN265の高品質ゲノムのdenovoアセンブリを実行しました。SN265とR99（インディカ）の交配に由来する組換え近交系（RIL）は、3つの異なる生態学的条件で再配列され、栽培されました。15の農業形質に関連する79のQTLを特定します。我々は、生態学的条件が変化したときにいくつかの遺伝子が機能変化を起こし、いくつかの対立遺伝子が異なる遺伝的背景に対して収縮した応答を示すことを発見した。CRISPR / Cas9遺伝子編集を使用して、穂の長さを決定する際の1つの候補遺伝子DEP1の関与を検証しました。結論：この研究は、イネ育種における機能遺伝子の適切な環境条件と遺伝的背景に関する情報を提供します。さらに、北ジャポニカSN265の参照ゲノムの公開は、植物生物学者と作物の遺伝的改善に貴重なリソースを提供します。"]
[101,30236054,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","osmotic stress/ABA-activated protein kinase 1 (SAPK1); SAPK2","BMC plant biology","The sucrose non-fermenting-1-related protein kinases SAPK1 and SAPK2 function collaboratively as positive regulators of salt stress tolerance in rice.",2018,"18(1):203","[Lou D et al.]","Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan,  China.",30236054,"10.1186/s12870-018-1408-0 ","BACKGROUND: The sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2 family (SnRK2s) unifies different abiotic stress signals in plants. To date, the functions of two rice SnRK2s, osmotic stress/ABA-activated protein kinase 1 (SAPK1) and SAPK2, have been unknown. We investigated their roles in response to salt stress by generating loss-of-function lines using the CRISPR/Cas9 system and by overexpressing these proteins in transgenic rice plants. RESULTS: Expression profiling revealed that SAPK1 and SAPK2 expression were strongly induced by drought, NaCl, and PEG treatment, but not by ABA. SAPK2 expression was highest in the leaves, followed by the roots, whereas SAPK1 was highest expressed in roots followed by leaves. Both proteins were localized to the nucleus and the cytoplasm. Under salt stress, sapk1, sapk2 and, in particular, sapk1/2 mutants, exhibited reduced germination rates, more severe growth inhibition, more distinct chlorosis, reduced chlorophyll contents, and reduced survival rates in comparison with the wild-type plants. In contrast, SAPK1- and SAPK2-overexpression lines had increased germination rates and reduced sensitivities to salt; including mild reductions in growth inhibition, reduced chlorosis, increased chlorophyll contents and improved survival rates in comparison with the wild-type plants. These results suggest that SAPK1 and SAPK2 may function collaboratively as positive regulators of salt stress tolerance at the germination and seedling stages. We also found that SAPK1 and SAPK2 affected the osmotic potential following salt stress by promoting the generation of osmotically active metabolites such as proline. SAPK1 and SAPK2 also improved reactive oxygen species (ROS) detoxification following salt stress by promoting the generation of ROS scavengers such as ascorbic acid, and by increasing the expression levels of  proteins such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). SAPK1 and SAPK2 may function collaboratively in reducing Na(+) toxicity by affecting the Na(+) distribution between roots and shoots, Na(+) exclusion from the cytoplasm, and Na(+) sequestration into the vacuoles. These effects may be facilitated through the expression of Na(+)-and K(+)-homeostasis-related genes. CONCLUSION: SAPK1 and SAPK2 may function collaboratively as positive regulators of salt stress tolerance at the germination and seedling stages in rice. SAPK1 and SAPK2 may be  useful to improve salt tolerance in crop plants.","rice","背景：ショ糖非発酵1関連プロテインキナーゼ2ファミリー（SnRK2s）は、植物のさまざまな非生物的ストレスシグナルを統合します。現在まで、2つのイネSnRK2、浸透圧ストレス/ ABA活性化プロテインキナーゼ1（SAPK1）とSAPK2の機能は不明でした。CRISPR / Cas9システムを使用して機能喪失ラインを生成し、トランスジェニックイネでこれらのタンパク質を過剰発現させることにより、塩ストレスに応答するそれらの役割を調査しました。結果：発現プロファイリングにより、SAPK1およびSAPK2の発現は干ばつ、NaCl、およびPEG処理によって強く誘導されたが、ABAによっては誘導されなかったことが明らかになりました。SAPK2の発現は葉で最も高く、次に根でしたが、SAPK1は根で最も高く、次に葉でした。両方のタンパク質は核と細胞質に局在していた。塩ストレス下では、sapk1、sapk2、特にsapk1 / 2変異体は、野生型植物と比較して、発芽率の低下、より重度の成長阻害、より明確な白化、クロロフィル含有量の低下、および生存率の低下を示しました。対照的に、SAPK1およびSAPK2の過剰発現系統では、発芽率が上昇し、塩に対する感受性が低下していました。野生型植物と比較して、成長阻害の軽度の減少、クロロシスの減少、クロロフィル含有量の増加、および生存率の改善が含まれます。これらの結果は、SAPK1とSAPK2が、発芽および苗の段階で塩分ストレス耐性の正の調節因子として協調的に機能する可能性があることを示唆しています。また、SAPK1とSAPK2は、プロリンなどの浸透圧的に活性な代謝物の生成を促進することにより、塩分ストレス後の浸透圧ポテンシャルに影響を与えることもわかりました。SAPK1とSAPK2は、アスコルビン酸などのROSスカベンジャーの生成を促進し、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）やカタラーゼ（CAT）などのタンパク質の発現レベルを上げることにより、塩ストレス後の活性酸素種（ROS）の無害化も改善しました。SAPK1とSAPK2は、根と新芽の間のNa（+）の分布、細胞質からのNa（+）の排除、液胞へのNa（+）の隔離に影響を与えることにより、Na（+）の毒性を低減するために協力して機能する可能性があります。これらの効果は、Na（+）-およ​​びK（+）-ホメオスタシス関連遺伝子の発現によって促進される可能性があります。結論：SAPK1とSAPK2は、イネの発芽期と実生期における塩ストレス耐性の正の調節因子として協調的に機能する可能性があります。SAPK1およびSAPK2は、作物の耐塩性を向上させるのに役立つ場合があります。"]
[102,30157762,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7 (CCD7)","BMC plant biology","Engineering plant architecture via CRISPR/Cas9-mediated alteration of strigolactone biosynthesis.",2018,"18(1):174","[Butt H et al.]","King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia.",30157762,"10.1186/s12870-018-1387-1 ","BACKGROUND: Precision plant genome engineering holds much promise for targeted improvement of crop traits via unprecedented single-base level control over the genetic material. Strigolactones (SLs) are a key determinant of plant architecture, known for their role in inhibiting shoot branching (tillering). RESULTS: We used CRISPR/Cas9 in rice (Oryza sativa) for targeted disruption of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7 (CCD7), which controls a key step in SL biosynthesis. The ccd7 mutants exhibited a striking increase in tillering, combined with a reduced height, which could be rescued by application of the synthetic SL analog GR24. Striga germination assays and liquid chromatography-mass spectrometry analysis showed that root exudates of ccd7 mutants were also SL deficient. CONCLUSIONS: Taken together, our results show the potential and feasibility of the use of the CRISPR/Cas9 system for targeted engineering of plant architecture and for elucidating the molecular underpinnings of architecture-related traits.","rice","背景：精密植物ゲノム工学は、遺伝物質に対する前例のない単一塩基レベルの制御を介して、作物特性の的を絞った改善に大きな期待を抱いています。ストリゴラクトン（SL）は、植物の構造の重要な決定要因であり、シュートの分岐（分げつ）を阻害する役割で知られています。結果：SL生合成の重要なステップを制御するCAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7（CCD7）の標的破壊のために、米（Oryza sativa）でCRISPR / Cas9を使用しました。ccd7変異体は、分げつが著しく増加し、高さが減少したことを示しました。これは、合成SLアナログGR24を適用することで救済できます。ストリガ発芽アッセイおよび液体クロマトグラフィー-質量分析は、ccd7変異体の根浸出液もSL欠損であることを示した。結論：まとめると、私たちの結果は、プラントアーキテクチャのターゲットエンジニアリングおよびアーキテクチャ関連の特性の分子基盤を解明するためのCRISPR / Cas9システムの使用の可能性と実現可能性を示しています。"]
[103,30081823,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","G2-like transcription factor, OsPHL3","BMC plant biology","Identification of a G2-like transcription factor, OsPHL3, functions as a negative regulator of flowering in rice by co-expression and reverse genetic analysis.",2018,"18(1):157","[Zeng L et al.]","Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30081823,"10.1186/s12870-018-1382-6 ","BACKGROUND: Flowering time is a key trait for regional adaption and seed production in rice (Oryza sativa L.). Forward and reverse genetic studies have characterized a number of flowering-time genes. However, co-expression analysis has not been used to identify the flowering-time genes. RESULTS: We predicted a G2-like family transcription factor, OsPHL3, by co-expression networks analysis with photoperiodic flowering pathway genes. OsPHL3 contains a MYB-CC domain, and  was localized in the nucleus with transcriptional activation potential. OsPHL3 was mainly expressed in the leaves and exhibited a circadian rhythmic expression  pattern. Rice lines overexpressing OsPHL3 showed a delayed flowering time in the  genetic background of TP309 under both long-day (Beijing) and short-day (Hainan)  conditions. By contrast, the knockout rice lines of OsPHL3 by CRISPR/Cas9 technology promoted flowering time regardless of genetic backgrounds (i.e. Nipponbare and TP309) or day length. Further analysis indicated that OsPHL3 delayed flowering time by down-regulating the expression of Hd3a and RFT1 through promoting Hd1 under long-day conditions (LDs), or suppressing Ehd1/Hd1 under short-day conditions (SDs). CONCLUSIONS: Our results suggested that co-expression analysis is a useful strategy for identifying novel flowering-time genes in rice.","rice","背景：開花時期は、米（Oryza sativa L.）の地域適応と種子生産の重要な特性です。順方向および逆方向の遺伝学的研究は、開花期の遺伝子の数を特徴づけています。ただし、共発現分析は開花期の遺伝子を特定するために使用されていません。結果：光周期的開花経路遺伝子との共発現ネットワーク分析により、G2様ファミリー転写因子OsPHL3を予測しました。OsPHL3にはMYB-CCドメインが含まれており、転写活性化の可能性がある核に局在していた。OsPHL3は主に葉に発現し、サーカディアンのリズミカルな発現パターンを示しました。OsPHL3を過剰発現する米系統は、長日（北京）と短日（ハイナン）の両方の条件下で、TP309の遺伝的背景において開花時間の遅延を示しました。対照的に、CRISPR / Cas9テクノロジーによるOsPHL3のノックアウトイネ系統は、遺伝的背景（すなわち、日本晴とTP309）や日長に関係なく開花時間を促進しました。さらなる分析により、OsPHL3は、長日条件下（LD）でHd1を促進するか、短日条件下（SD）でEhd1 / Hd1を抑制することにより、Hd3aおよびRFT1の発現をダウンレギュレートすることにより、開花時間を遅らせることが示されました。結論：私たちの結果は、共発現分析が米の新しい開花期遺伝子を同定するための有用な戦略であることを示唆しました。"]
[104,30246111,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","acetolactate synthase (ALS) ","Data in brief","Herbicide tolerance-assisted multiplex targeted nucleotide substitution in rice.",2018,"20:1325-1331","[Shimatani Z et al.]","Kobe University, Kobe, Hyogo, Japan.",30246111,"10.1016/j.dib.2018.08.124 ","Acetolactate synthase (ALS) catalyzes the initial step in the biosynthesis of branched-chain amino acids, and is highly conserved from bacteria to higher plants. ALS is encoded by a single copy gene in rice genome and is a target enzyme of several classes of herbicides. Although ALS mutations conferring herbicide-resistance property to plants are well documented, effect of Imazamox (IMZ) on rice and the mutations in ALS correlated with IMZ tolerance were unclear. In this article, the effect of IMZ on rice calli and seedlings in tissue culture conditions were evaluated. Also, the ALSA96V mutation was confirmed to improve IMZ tolerance of rice calli. Based on these results, ALS-assisted multiplex targeted base editing in rice was demonstrated in combination with Target-AID, a CRISPR/Cas9-cytidine deaminase fusion system [1], [2].","rice","アセト乳酸シンターゼ（ALS）は、分岐鎖アミノ酸の生合成の最初のステップを触媒し、細菌から高等植物まで高度に保存されています。ALSは、イネゲノムの単一コピー遺伝子によってコードされており、いくつかのクラスの除草剤の標的酵素です。植物に除草剤耐性特性を与えるALS変異は十分に立証されていますが、イマザモックス（IMZ）の米への影響と、IMZ耐性と相関するALSの変異は不明でした。この記事では、組織培養条件でのイネカルスと実生に対するIMZの影響を評価しました。また、ALSA96V変異は、イネカルスのIMZ耐性を改善することが確認されました。これらの結果に基づいて、イネにおけるALS支援マルチプレックスターゲット塩基編集は、CRISPR / Cas9-シチジンデアミナーゼ融合システムであるTarget-AIDと組み合わせて実証されました[1]、[2]。"]
[105,29692796,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","ERECTA genes (OsER1; OsER2)","Frontiers in plant science","Phylogenetic and CRISPR/Cas9 Studies in Deciphering the Evolutionary Trajectory and Phenotypic Impacts of Rice ERECTA Genes.",2018,"9:473","[Zhang Y et al.]","Nanjing University, Nanjing, China.",29692796,"10.3389/fpls.2018.00473 ","The ERECTA family genes (ERfs) have been found to play diverse functions in Arabidopsis, including controlling cell proliferation and cell growth, regulating stomata patterning, and responding to various stresses. This wide range of functions has rendered them as a potential candidate for crop improvement. However, information on their functional roles, particularly their morphological  impact, in crop genomes, such as rice, is limited. Here, through evolutionary prediction, we first depict the evolutionary trajectory of the ER family, and show that the ER family is actually highly conserved across different species, suggesting that most of their functions may also be observed in other plant species. We then take advantage of the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated nuclease 9) system to assess their morphological impact on one of the most important crops, rice. Loss-of-function mutants of OsER1 and OsER2 display shortened plant stature and reduced panicle size, suggesting they possibly also functioned in regulating cell proliferation and cell growth in rice. In addition to functions similar to that in Arabidopsis, we also find clues that rice ERfs may play unique functional roles. The OsER2 displayed more severe phenotypic changes than OsER1, indicating  putative differentiation in their functions. The OsERL might be of essential in its function, and the proper function of all three rice ER genes might be dependent of their genetic background. Future investigations relating to these functions are key to exploiting ERfs in crop development.","rice","ERECTAファミリー遺伝子（ERfs）は、細胞増殖と細胞増殖の制御、気孔パターンの調節、さまざまなストレスへの応答など、アラビドプシスで多様な機能を果たすことがわかっています。この幅広い機能により、作物改良の潜在的な候補となっています。ただし、米などの作物ゲノムにおけるそれらの機能的役割、特に形態学的影響に関する情報は限られています。ここでは、進化的予測を通じて、最初にERファミリーの進化の軌跡を描き、ERファミリーが実際にはさまざまな種で高度に保存されていることを示します。これは、それらの機能のほとんどが他の植物種でも観察される可能性があることを示唆しています。次に、CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート関連ヌクレアーゼ9）システムを利用して、最も重要な作物の1つであるイネに対する形態学的影響を評価します。OsER1とOsER2の機能喪失型変異体は、植物の身長の短縮とパニクルサイズの縮小を示しており、米の細胞増殖と細胞増殖の調節にも機能している可能性があります。シロイヌナズナと同様の機能に加えて、イネのERfが独特の機能的役割を果たしている可能性があるという手がかりもあります。OsER2は、OsER1よりも深刻な表現型の変化を示し、それらの機能の推定上の分化を示しています。OsERLはその機能に不可欠である可能性があり、3つの米ER遺伝子すべての適切な機能はそれらの遺伝的背景に依存している可能性があります。これらの機能に関連する将来の調査は、作物開発においてERfを活用するための鍵となります。"]
[106,29643863,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsABA2","Frontiers in plant science","Mutation in Rice Abscisic Acid2 Results in Cell Death, Enhanced Disease-Resistance, Altered Seed Dormancy and Development.",2018,"9:405","[Liao Y et al.]","Sichuan Agricultural University, Sichuan, China.",29643863,"10.3389/fpls.2018.00405 ","Lesion mimic mutants display spontaneous cell death, and thus are valuable for understanding the molecular mechanism of cell death and disease resistance. Although a lot of such mutants have been characterized in rice, the relationship  between lesion formation and abscisic acid (ABA) synthesis pathway is not reported. In the present study, we identified a rice mutant, lesion mimic mutant  9150 (lmm9150), exhibiting spontaneous cell death, pre-harvest sprouting, enhanced growth, and resistance to rice bacterial and blast diseases. Cell death  in the mutant was accompanied with excessive accumulation of H2O2. Enhanced disease resistance was associated with cell death and upregulation of defense-related genes. Map-based cloning identified a G-to-A point mutation resulting in a D-to-N substitution at the amino acid position 110 of OsABA2 (LOC_Os03g59610) in lmm9150. Knock-out of OsABA2 through CRISPR/Cas9 led to phenotypes similar to those of lmm9150. Consistent with the function of OsABA2 in ABA biosynthesis, ABA level in the lmm9150 mutant was significantly reduced. Moreover, exogenous application of ABA could rescue all the mutant phenotypes of  lmm9150. Taken together, our data linked ABA deficiency to cell death and provided insight into the role of ABA in rice disease resistance.","rice","病変模倣変異体は自発的な細胞死を示すため、細胞死と耐病性の分子メカニズムを理解するのに役立ちます。そのような突然変異体の多くはイネで特徴づけられていますが、病斑形成とアブシジン酸（ABA）合成経路との関係は報告されていません。本研究では、イネの突然変異体、病変模倣突然変異体9150（lmm9150）を同定しました。これは、自発的な細胞死、収穫前の発芽、成長の促進、イネの細菌および芽球病に対する抵抗性を示します。変異体の細胞死は、H2O2の過剰な蓄積を伴っていた。耐病性の強化は、細胞死と防御関連遺伝子のアップレギュレーションに関連していた。マップベースのクローニングにより、lmm9150のOsABA2（LOC_Os03g59610）のアミノ酸位置110でDからNへの置換をもたらすGからAへのポイント変異が特定されました。CRISPR / Cas9を介したOsABA2のノックアウトは、lmm9150と同様の表現型をもたらしました。ABA生合成におけるOsABA2の機能と一致して、lmm9150変異体のABAレベルは有意に減少しました。さらに、ABAの外因性アプリケーションは、lmm9150のすべての変異表現型を救うことができます。まとめると、私たちのデータはABA欠乏を細胞死に関連付け、イネの耐病性におけるABAの役割についての洞察を提供しました。"]
[107,29973285,"plant","rice","CRISPR;Cas9;Cpf1;"," ","Genome biology","A large-scale whole-genome sequencing analysis reveals highly specific genome editing by both Cas9 and Cpf1 (Cas12a) nucleases in rice.",2018,"19(1):84","[Tang X et al.]","University of Electronic Science and Technology of China,  Chengdu, China.",29973285,"10.1186/s13059-018-1458-5 ","BACKGROUND: Targeting specificity has been a barrier to applying genome editing systems in functional genomics, precise medicine and plant breeding. In plants, only limited studies have used whole-genome sequencing (WGS) to test off-target effects of Cas9. The cause of numerous discovered mutations is still controversial. Furthermore, WGS-based off-target analysis of Cpf1 (Cas12a) has not been reported in any higher organism to date. RESULTS: We conduct a WGS analysis of 34 plants edited by Cas9 and 15 plants edited by Cpf1 in T0 and T1 generations along with 20 diverse control plants in rice. The sequencing depths range from 45x to 105x with read mapping rates above 96%. Our results clearly show that most mutations in edited plants are created by the tissue culture process, which causes approximately 102 to 148 single nucleotide variations (SNVs) and approximately 32 to 83 insertions/deletions (indels) per plant. Among  12 Cas9 single guide RNAs (sgRNAs) and three Cpf1 CRISPR RNAs (crRNAs) assessed by WGS, only one Cas9 sgRNA resulted in off-target mutations in T0 lines at sites predicted by computer programs. Moreover, we cannot find evidence for bona fide off-target mutations due to continued expression of Cas9 or Cpf1 with guide RNAs  in T1 generation. CONCLUSIONS: Our comprehensive and rigorous analysis of WGS data across multiple sample types suggests both Cas9 and Cpf1 nucleases are very  specific in generating targeted DNA modifications and off-targeting can be avoided by designing guide RNAs with high specificity.","rice","背景：ターゲットの特異性は、機能ゲノミクス、精密医療、植物育種にゲノム編集システムを適用する際の障壁となっています。植物では、Cas9のオフターゲット効果をテストするために全ゲノムシーケンス（WGS）を使用した研究は限られています。発見された多数の突然変異の原因はまだ議論の余地があります。さらに、Cpf1（Cas12a）のWGSベースのオフターゲット分析は、これまでどの高等生物でも報告されていません。結果：Cas9によって編集された34の植物、Cpf1によって編集されたT0およびT1世代の15の植物、およびイネの20の多様な対照植物のWGS分析を実施します。シーケンス深度は45倍から105倍の範囲で、読み取りマッピング率は96％を超えます。私たちの結果は、編集された植物のほとんどの変異が組織培養プロセスによって作成され、植物ごとに約102〜148の単一ヌクレオチド変異（SNV）と約32〜83の挿入/削除（インデル）を引き起こすことを明確に示しています。WGSによって評価された12個のCas9シングルガイドRNA（sgRNA）と3個のCpf1 CRISPR RNA（crRNA）のうち、コンピュータープログラムによって予測された部位でT0ラインにオフターゲット変異をもたらしたのは1個のCas9sgRNAだけでした。さらに、T1生成でガイドRNAを使用してCas9またはCpf1が継続的に発現するため、真正なオフターゲット変異の証拠を見つけることができません。結論：複数のサンプルタイプにわたるWGSデータの包括的かつ厳密な分析は、Cas9およびCpf1ヌクレアーゼの両方がターゲットDNA修飾の生成に非常に特異的であり、高い特異性を持つガイドRNAを設計することでオフターゲットを回避できることを示唆しています。"]
[108,30602689,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","asparagine synthetase 1 (OsASN1)","International journal of molecular sciences","OsASN1 Plays a Critical Role in Asparagine-Dependent Rice Development.",2018,"20(1)","[Luo L et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",30602689,"10.3390/ijms20010130 ","Asparagine is one of the important amino acids for long-distance transport of nitrogen (N) in plants. However, little is known about the effect of asparagine on plant development, especially in crops. Here, a new T-DNA insertion mutant, asparagine synthetase 1 (asn1), was isolated and showed a different plant height, root length, and tiller number compared with wild type (WT). In asn1, the amount  of asparagine decreased sharply while the total nitrogen (N) absorption was not influenced. In later stages, asn1 showed reduced tiller number, which resulted in suppressed tiller bud outgrowth. The relative expression of many genes involved in the asparagine metabolic pathways declined in accordance with the decreased amino acid concentration. The CRISPR/Cas9 mutant lines of OsASN1 showed similar phenotype with asn1. These results suggest that OsASN1 is involved in the regulation of rice development and is specific for tiller outgrowth.","rice","アスパラギンは、植物の窒素（N）の長距離輸送に重要なアミノ酸の1つです。しかし、特に作物における植物の発達に対するアスパラギンの影響についてはほとんど知られていません。ここでは、新しいT-DNA挿入変異体であるアスパラギンシンテターゼ1（asn1）が単離され、野生型（WT）と比較して異なる草丈、根の長さ、分げつ数を示しました。asn1では、アスパラギンの量は急激に減少しましたが、全窒素（N）吸収は影響を受けませんでした。後の段階で、asn1は分げつ数の減少を示し、その結果、分げつ芽の成長が抑制されました。アスパラギン代謝経路に関与する多くの遺伝子の相対的発現は、アミノ酸濃度の低下に応じて低下しました。OsASN1のCRISPR / Cas9変異株は、asn1と同様の表現型を示しました。これらの結果は、OsASN1が米の発育の調節に関与しており、分げつ成長に特異的であることを示唆している。"]
[109,30545137,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","glycerol-3-phosphate acyltransferase (OsGPAT3)","International journal of molecular sciences","OsGPAT3 Plays a Critical Role in Anther Wall Programmed Cell Death and Pollen Development in Rice.",2018,"19(12)","[Sun L et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",30545137,"10.3390/ijms19124017 ","In flowering plants, ideal male reproductive development requires the systematic  coordination of various processes, in which timely differentiation and degradation of the anther wall, especially the tapetum, is essential for both pollen formation and anther dehiscence. Here, we show that OsGPAT3, a conserved glycerol-3-phosphate acyltransferase gene, plays a critical role in regulating anther wall degradation and pollen exine formation. The gpat3-2 mutant had defective synthesis of Ubisch bodies, delayed programmed cell death (PCD) of the  inner three anther layers, and abnormal degradation of micropores/pollen grains,  resulting in failure of pollen maturation and complete male sterility. Complementation and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) experiments demonstrated that OsGPAT3 is responsible for the male sterility phenotype. Furthermore, the expression level of tapetal PCD-related and nutrient metabolism-related genes changed significantly in the gpat3-2 anthers. Based on these genetic and cytological analyses, OsGPAT3 is proposed to coordinate the differentiation and degradation of the anther wall and pollen grains in addition to regulating lipid biosynthesis. This study provides insights for understanding the function of GPATs in regulating rice male reproductive development, and also lays a theoretical basis for hybrid rice breeding.","rice","開花植物では、理想的な男性の生殖発達には、葯壁、特にタペタムの適時の分化と分解が花粉形成と葯裂開の両方に不可欠であるさまざまなプロセスの体系的な調整が必要です。ここでは、保存されたグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子であるOsGPAT3が、葯壁の分解と花粉外皮形成の調節に重要な役割を果たしていることを示します。gpat3-2変異体は、ユビッシュ体の合成に欠陥があり、内側の3つの葯層のプログラム細胞死（PCD）が遅れ、微細孔/花粉粒の異常な分解が起こり、花粉の成熟に失敗し、完全な雄性不稔をもたらしました。相補性とクラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（Cas9）実験は、OsGPAT3が男性の不妊表現型の原因であることを示しました。さらに、タペタルPCD関連および栄養代謝関連遺伝子の発現レベルはgpat3-2葯で有意に変化しました。これらの遺伝的および細胞学的分析に基づいて、OsGPAT3は、脂質生合成の調節に加えて、葯壁と花粉粒の分化と分解を調整するために提案されています。この研究は、米の男性の生殖発達の調節におけるGPATの機能を理解するための洞察を提供し、ハイブリッド米育種の理論的基礎も築きます。"]
[110,30042352,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","White Belly 1 (WB1)","International journal of molecular sciences","WB1, a Regulator of Endosperm Development in Rice, Is Identified by a Modified MutMap Method.",2018,"19(8)","[Wang H et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, Zhejiang, China.",30042352,"10.3390/ijms19082159 ","Abnormally developed endosperm strongly affects rice (Oryza sativa) appearance quality and grain weight. Endosperm formation is a complex process, and although  many enzymes and related regulators have been identified, many other related factors remain largely unknown. Here, we report the isolation and characterization of a recessive mutation of White Belly 1 (WB1), which regulates  rice endosperm development, using a modified MutMap method in the rice mutant wb1. The wb1 mutant develops a white-belly endosperm and abnormal starch granules in the inner portion of white grains. Representative of the white-belly phenotype, grains of wb1 showed a higher grain chalkiness rate and degree and a lower 1000-grain weight (decreased by ~34%), in comparison with that of Wild Type (WT). The contents of amylose and amylopectin in wb1 significantly decreased, and its physical properties were also altered. We adopted the modified MutMap method  to identify 2.52 Mb candidate regions with a high specificity, where we detected  275 SNPs in chromosome 4. Finally, we identified 19 SNPs at 12 candidate genes. Transcript levels analysis of all candidate genes showed that WB1 (Os04t0413500), encoding a cell-wall invertase, was the most probable cause of white-belly endosperm phenotype. Switching off WB1 with the CRISPR/cas9 system in Japonica cv. Nipponbare demonstrates that WB1 regulates endosperm development and that different mutations of WB1 disrupt its biological function. All of these results  taken together suggest that the wb1 mutant is controlled by the mutation of WB1,  and that the modified MutMap method is feasible to identify mutant genes, and could promote genetic improvement in rice.","rice","異常に発達した胚乳は、イネ（Oryza sativa）の外観品質と穀粒重量に強く影響します。胚乳の形成は複雑なプロセスであり、多くの酵素と関連する調節因子が同定されていますが、他の多くの関連する要因はほとんど知られていないままです。ここでは、米の突然変異体wb1で修正されたMutMapメソッドを使用して、米の内胚葉の発達を調節するWhite Belly 1（WB1）の劣性突然変異の分離と特性評価を報告します。wb1変異体は、白い粒の内部に白い腹の内胚葉と異常なデンプン粒を発達させます。白腹の表現型を代表するwb1の粒子は、野生型（WT）と比較して、粒子の白亜化率と程度が高く、1000粒子の重量が低い（約34％減少）。wb1のアミロースとアミロペクチンの含有量は大幅に減少し、その物性も変化しました。修正MutMap法を採用して、特異性の高い2.52 Mb候補領域を特定し、染色体4で275のSNPを検出しました。最後に、12の候補遺伝子で19のSNPを特定しました。すべての候補遺伝子の転写レベル分析は、細胞壁インベルターゼをコードするWB1（Os04t0413500）が白腹胚乳表現型の最も可能性の高い原因であることを示しました。JaponicacvのCRISPR / cas9システムでWB1をオフにします。日本晴は、WB1が胚乳の発達を調節し、WB1のさまざまな変異がその生物学的機能を破壊することを示しています。これらすべての結果を総合すると、wb1変異体はWB1の変異によって制御されており、修正されたMutMap法は変異遺伝子を特定するのに実行可能であり、米の遺伝的改善を促進する可能性があることを示唆しています。"]
[111,30032251,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","ERF domain protein FZP","Journal of experimental botany","FZP determines grain size and sterile lemma fate in rice.",2018,"69(20):4853-4866","[Ren D et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",30032251,"10.1093/jxb/ery264 ","In grass, the spikelet is a unique inflorescence structure that directly determines grain yield. Despite a great deal of research, the molecular mechanisms behind spikelet development are not fully understood. In the study, FZP encodes an ERF domain protein, and functions in grain size and sterile lemma  identity. Mutation of FZP causes smaller grains and degenerated sterile lemmas. The small fzp-12 grains were caused by a reduction in cell number and size in the hulls. Interestingly, the sterile lemma underwent a homeotic transformation into  a rudimentary glume in the fzp-12 and fzp-13 mutants, whereas the sterile lemma underwent a homeotic transformation into a lemma in FZP over-expressing plants, suggesting that FZP specifically determines the sterile lemma identity. We confirmed the function of FZP by complementation, CRISPR-Cas9 gene editing, and cytological and molecular tests. Additionally, FZP interacts specifically with the GCC-box and DRE motifs, and may be involved in regulation of the downstream genes. Our results revealed that FZP plays a vital role in the regulation of grain size, and first provides clear evidence in support of the hypothesis that the lemma, rudimentary glume, and sterile lemma are homologous organs.","rice","草では、スパイクレットは穀物の収量を直接決定するユニークな花序構造です。多くの研究にもかかわらず、スパイクレットの発達の背後にある分子メカニズムは完全には理解されていません。この研究では、FZPはERFドメインタンパク質をエンコードし、粒子サイズと無菌レンマの同一性で機能します。FZPの突然変異は、より小さな粒と退化した無菌の見出語を引き起こします。小さなfzp-12粒子は、船体のセル数とサイズの減少によって引き起こされました。興味深いことに、無菌レンマはfzp-12およびfzp-13変異体で基本的な籾殻へのホメオティック変換を受けましたが、無菌レンマはFZP過剰発現植物でレンマへのホメオティック変換を受け、FZPが無菌レンマを特異的に決定することを示唆しています身元。FZPの機能は、相補性、CRISPR-Cas9遺伝子編集、細胞学的および分子的テストによって確認されました。さらに、FZPはGCCボックスおよびDREモチーフと特異的に相互作用し、下流の遺伝子の調節に関与している可能性があります。私たちの結果は、FZPが粒子サイズの調節に重要な役割を果たしていることを明らかにし、最初に、補題、初歩的な籾殻、および無菌の補題が相同器官であるという仮説を支持する明確な証拠を提供します。"]
[112,29955893,"plant","rice","CRISPR;Cpf1;","ALS","Journal of experimental botany","Synthesis-dependent repair of Cpf1-induced double strand DNA breaks enables targeted gene replacement in rice.",2018,"69(20):4715-4721","[Li S et al.]","Institute of Crop Sciences (ICS), Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing, China.",29955893,"10.1093/jxb/ery245 ","The recently developed CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic  repeats)/Cpf1 system expands the range of genome editing and is emerging as an alternative powerful tool for both plant functional genomics and crop improvement. Cpf1-CRISPR RNA (crRNA) produces double strand DNA breaks (DSBs) with long 5'-protruding ends, which may facilitate the pairing and insertion of repair templates through homology-directed repair (HDR) for targeted gene replacement and introduction of the desired DNA elements at specific gene loci for crop improvement. However, the potential mechanism underlying HDR of DSBs generated by Cpf1-crRNA remains to be investigated, and the inherent low efficiency of HDR and poor availability of exogenous donor DNA as repair templates strongly impede the use of HDR for precise genome editing in crop plants. Here, we provide evidence of synthesis-dependent repair of Cpf1-induced DSBs, which enables us precisely to replace the wild-type ALS gene with the intended mutant version that carries two discrete point mutations conferring herbicide resistance to rice plants. Our observation that the donor repair template (DRT) with only the left homologous arm is sufficient for precise targeted allele replacement offers a better understanding of the mechanism underlying HDR in plants, and greatly simplifies the design of DRTs for precision genome editing in crop improvement.","rice","最近開発されたCRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）/ Cpf1システムは、ゲノム編集の範囲を拡大し、植物機能ゲノミクスと作物改良の両方のための代替の強力なツールとして浮上しています。Cpf1-CRISPR RNA（crRNA）は、長い5 '突出末端を持つ二本鎖DNA切断（DSB）を生成します。これにより、標的遺伝子の置換と目的の遺伝子の導入のための相同性指向修復（HDR）による修復テンプレートのペアリングと挿入が容易になります。作物改良のための特定の遺伝子座のDNA要素。ただし、Cpf1-crRNAによって生成されたDSBのHDRの根底にある潜在的なメカニズムはまだ調査されておらず、HDRの固有の低効率と、修復テンプレートとしての外因性ドナーDNAの利用可能性の低さは、作物植物での正確なゲノム編集のためのHDRの使用を強く妨げています。ここでは、Cpf1によって誘発されたDSBの合成依存修復の証拠を提供します。これにより、野生型ALS遺伝子を、米植物に除草剤耐性を付与する2つの個別の点突然変異を運ぶ意図された突然変異バージョンに正確に置き換えることができます。左の相同アームのみを備えたドナー修復テンプレート（DRT）が正確な標的対立遺伝子置換に十分であるという我々の観察は、植物のHDRの根底にあるメカニズムのより良い理解を提供し、作物改良における精密ゲノム編集のためのDRTの設計を大幅に簡素化します。"]
[113,29300985,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","an important subunit of the exocyst complex (OsSEC3A)","Journal of experimental botany","Disruption of OsSEC3A increases the content of salicylic acid and induces plant defense responses in rice.",2018,"69(5):1051-1064","[Ma J et al.]","Peking University, Beijing, China.",29300985,"10.1093/jxb/erx458 ","The exocyst, an evolutionarily conserved octameric protein complex involved in exocytosis, has been reported to be involved in diverse aspects of morphogenesis  in Arabidopsis. However, the molecular functions of such exocytotic molecules in  rice are poorly understood. Here, we examined the molecular function of OsSEC3A,  an important subunit of the exocyst complex in rice. The OsSEC3A gene is expressed in various organs, and OsSEC3A has the potential ability to participate in the exocyst complex by interacting with several other exocyst subunits. Disruption of OsSEC3A by CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) caused dwarf stature and a lesion-mimic phenotype. The Ossec3a mutant exhibited enhanced defense responses,  as shown by up-regulated transcript levels of pathogenesis- and salicylic acid synthesis-related genes, increased levels of salicylic acid, and enhanced resistance to the fungal pathogen Magnaporthe oryzae. Subcellular localization analysis demonstrated that OsSEC3A has a punctate distribution with the plasma membrane. In addition, OsSEC3A interacted with rice SNAP25-type t-SNARE protein OsSNAP32, which is involved in rice blast resistance, via the C-terminus and bound to phosphatidylinositol lipids, particularly phosphatidylinositol-3-phosphate, through its N-terminus. These findings uncover  the novel function of rice exocyst subunit SEC3 in defense responses.","rice","エキソサイトーシスに関与する進化的に保存された八量体タンパク質複合体であるエキソシストは、アラビドプシスの形態形成の多様な側面に関与していることが報告されています。しかし、イネにおけるそのようなエキソサイトーシス分子の分子機能はよくわかっていません。ここでは、米のエキソシスト複合体の重要なサブユニットであるOsSEC3Aの分子機能を調べました。OsSEC3A遺伝子はさまざまな器官で発現しており、OsSEC3Aは、他のいくつかのエキソシストサブユニットと相互作用することにより、エキソシスト複合体に参加する潜在的な能力を持っています。CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）によるOsSEC3Aの破壊は、矮性の身長と病変を模倣した表現型を引き起こしました。Ossec3a変異体は、病因およびサリチル酸合成関連遺伝子のアップレギュレートされた転写レベル、サリチル酸レベルの増加、および真菌病原体Magnaporthe oryzaeに対する耐性の強化によって示されるように、防御応答の強化を示しました。細胞内局在分析は、OsSEC3Aが原形質膜と点状に分布していることを示した。さらに、OsSEC3Aは、C末端を介してイネいもち菌耐性に関与し、N末端を介してホスファチジルイノシトール脂質、特にホスファチジルイノシトール-3-リン酸に結合するイネいもち菌SNAP25型t-SNAREタンパク質OsSNAP32と相互作用しました。これらの発見は、防御反応における米エキソシストサブユニットSEC3の新しい機能を明らかにしています。"]
[114,29762900,"plant","rice","CRISPR;Cas9;Cpf1;"," ","Journal of integrative plant biology","Multiplex gene editing in rice with simplified CRISPR-Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems.",2018,"60(8):626-631","[Wang M et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",29762900,"10.1111/jipb.12667 ","We developed simplified single transcriptional unit (SSTU) CRISPR systems for multiplex gene editing in rice using FnCpf1, LbCpf1 or Cas9, in which the nuclease and its crRNA array are co-expressed from a single Pol II promoter, without any additional processing machinery. Our SSTU systems are easy to construct and effective in mediating multiplex genome editing.","rice","FnCpf1、LbCpf1、またはCas9を使用して、イネの多重遺伝子編集用の簡略化された単一転写ユニット（SSTU）CRISPRシステムを開発しました。このシステムでは、ヌクレアーゼとそのcrRNAアレイが、追加の処理機構なしで単一のPolIIプロモーターから共発現します。当社のSSTUシステムは、構築が簡単で、マルチプレックスゲノム編集の仲介に効果的です。"]
[115,29575650,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","NRT1.1B","Journal of integrative plant biology","Efficient allelic replacement in rice by gene editing: A case study of the NRT1.1B gene.",2018,"60(7):536-540","[Li J et al.]","Institute of Crop Sciences (ICS), Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing, China.",29575650,"10.1111/jipb.12650 ","Precise replacement of an existing allele in commercial cultivars with an elite allele is a major goal in crop breeding. A single nucleotide polymorphism in the  NRT1.1B gene between japonica and indica rice is responsible for the improved nitrogen use efficiency in indica rice. Herein, we precisely replaced the japonica NRT1.1B allele with the indica allele, in just one generation, using CRISPR/Cas9 gene-editing technology. No additional selective pressure was needed  to enrich the precise replacement events. This work demonstrates the feasibility  of replacing any genes with elite alleles within one generation, greatly expanding our ability to improve agriculturally important traits.","rice","商業栽培品種の既存の対立遺伝子をエリート対立遺伝子に正確に置き換えることは、作物育種の主要な目標です。ジャポニカとインディカ米の間のNRT1.1B遺伝子の一塩基多型は、インディカ米の窒素利用効率の改善に関与しています。ここでは、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を使用して、ジャポニカNRT1.1B対立遺伝子をインディカ対立遺伝子にわずか1世代で正確に置き換えました。正確な交換イベントを充実させるために、追加の選択圧は必要ありませんでした。この作品は、1世代以内に遺伝子をエリート対立遺伝子に置き換える可能性を示しており、農業的に重要な特性を改善する能力を大幅に拡大しています。"]
[116,29210506,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Waxy","Journal of integrative plant biology","Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy  gene in elite rice varieties.",2018,"60(5):369-375","[Zhang J et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",29210506,"10.1111/jipb.12620 ","In rice, amylose content (AC) is controlled by a single dominant Waxy gene. We used Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) to introduce a loss-of-function mutation into the Waxy gene in two widely cultivated elite japonica varieties. Our results show that mutations in the Waxy gene reduce AC and convert the rice into glutinous ones without affecting other desirable agronomic traits, offering an effective and easy strategy to improve glutinosity in elite varieties. Importantly, we successfully removed the transgenes from the progeny. Our study provides an example of generating improved crops with potential for commercialization, by editing a gene of interest directly in elite crop varieties.","rice","米では、アミロース含有量（AC）は単一の優勢なWaxy遺伝子によって制御されます。Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/ CRISPR-Associated 9（Cas9）を使用して、広く栽培されている2つのエリートジャポニカ品種のWaxy遺伝子に機能喪失型変異を導入しました。私たちの結果は、Waxy遺伝子の変異がACを低下させ、他の望ましい農業特性に影響を与えることなく米をグルチナスに変換し、エリート品種のグルチノシティを改善するための効果的で簡単な戦略を提供することを示しています。重要なのは、子孫から導入遺伝子をうまく除去したことです。私たちの研究は、エリート作物の品種で関心のある遺伝子を直接編集することにより、商品化の可能性がある改良作物を生成する例を提供します。"]
[117,29319227,"plant","rice","CRISPR;","FRUCTOKINASE-LIKE PROTEIN (OsFLN1)","Journal of integrative plant biology","FRUCTOKINASE-LIKE PROTEIN 1 interacts with TRXz to regulate chloroplast development in rice.",2018,"60(2):94-111","[He L et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",29319227,"10.1111/jipb.12631 ","Chloroplast genes are transcribed by the plastid-encoded RNA polymerase (PEP) or  nucleus-encoded RNA polymerase. FRUCTOKINASE-LIKE PROTEINS (FLNs) are phosphofructokinase-B (PfkB)-type carbohydrate kinases that act as part of the PEP complex; however, the molecular mechanisms underlying FLN activity in rice remain elusive. Previously, we identified and characterized a heat-stress sensitive albino (hsa1) mutant in rice. Map-based cloning revealed that HSA1 encodes a putative OsFLN2. Here, we further demonstrated that knockdown or knockout of the OsFLN1, a close homolog of HSA1/OsFLN2, considerably inhibits chloroplast biogenesis and the fln1 knockout mutants, created by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associate protein 9, exhibit severe albino phenotype and seedling lethality. Moreover, OsFLN1 localizes to the chloroplast. Yeast two-hybrid, pull-down and bimolecular  fluorescence complementation experiments revealed that OsFLN1 and HSA1/OsFLN2 interact with THIOREDOXINZ (OsTRXz) to regulate chloroplast development. In agreement with this, knockout of OsTRXz resulted in a similar albino and seedling lethality phenotype to that of the fln1 mutants. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction and immunoblot analysis revealed that the transcription and translation of PEP-dependent genes were strongly inhibited in fln1 and trxz mutants, indicating that loss of OsFLN1, HSA1/OsFLN2, or OsTRXz function perturbs the stability of the transcriptionally active chromosome complex and PEP activity. These results show that OsFLN1 and HSA1/OsFLN2 contribute to chloroplast biogenesis and plant growth.","rice","クロロプラスト遺伝子は、プラスチドにコードされたRNAポリメラーゼ（PEP）または核にコードされたRNAポリメラーゼによって転写されます。FRUCTOKINASE-LIKE PROTEINS（FLN）は、PEP複合体の一部として機能するホスホフルクトキナーゼ-B（PfkB）タイプの炭水化物キナーゼです。ただし、米のFLN活動の根底にある分子メカニズムはとらえどころのないままです。以前、イネの熱ストレス感受性アルビノ（hsa1）変異体を同定し、特徴づけました。マップベースのクローニングにより、HSA1が推定上のOsFLN2をエンコードしていることが明らかになりました。ここでは、HSA1 / OsFLN2の密接なホモログであるOsFLN1のノックダウンまたはノックアウトが、葉緑体の生合成を大幅に阻害し、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）とCRISPR関連タンパク質9によって作成されたfln1ノックアウト変異体が示すことをさらに示しました。重度のアルビノ表現型と苗の致死性。さらに、OsFLN1は葉緑体に局在します。酵母2ハイブリッド、プルダウン、および2分子蛍光補完実験により、OsFLN1およびHSA1 / OsFLN2がTHIOREDOXINZ（OsTRXz）と相互作用して、葉緑体の発達を調節することが明らかになりました。これと一致して、OsTRXzのノックアウトは、fln1変異体と同様のアルビノおよび実生の致死性の表現型をもたらしました。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびイムノブロット分析により、PEP依存性遺伝子の転写および翻訳がfln1およびtrxz変異体で強く阻害されることが明らかになり、OsFLN1、HSA1 / OsFLN2、またはOsTRXz機能の喪失が転写活性染色体の安定性を混乱させることが示されました複雑でPEPの活動。これらの結果は、OsFLN1とHSA1 / OsFLN2が葉緑体の生合成と植物の成長に寄与することを示しています。"]
[118,27628577,"plant","rice","CRISPR;Cas9;"," ","Journal of integrative plant biology","QTL editing confers opposing yield performance in different rice varieties.",2018,"60(2):89-93","[Shen L et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",27628577,"10.1111/jipb.12501 ","Grain yield is one of the most important and complex trait for genetic improvement in crops; it is known to be controlled by a number of genes known as  quantitative trait loci (QTLs). In the past decade, many yield-contributing QTLs  have been identified in crops. However, it remains unclear whether those QTLs confer the same yield performance in different genetic backgrounds. Here, we performed CRISPR/Cas9-mediated QTL editing in five widely-cultivated rice varieties and revealed that the same QTL can have diverse, even opposing, effects on grain yield in different genetic backgrounds.","rice","穀物収量は、作物の遺伝的改善にとって最も重要で複雑な特性の1つです。量的形質遺伝子座（QTL）として知られる多くの遺伝子によって制御されることが知られています。過去10年間で、多くの収量に寄与するQTLが作物で確認されています。ただし、これらのQTLが異なる遺伝的背景で同じ歩留まり性能をもたらすかどうかは不明なままです。ここでは、5つの広く栽培されているイネ品種でCRISPR / Cas9を介したQTL編集を実行し、同じQTLが異なる遺伝的背景の穀物収量に多様な、さらには反対の影響を与える可能性があることを明らかにしました。"]
[119,29199103,"plant","rice","CRISPR;","six genes encoding enzymes of acyl-ACP-consuming pathways including PlsX","Metabolic engineering","Diversion of the long-chain acyl-ACP pool in Synechocystis to fatty alcohols through CRISPRi repression of the essential phosphate acyltransferase PlsX.",2018,"45:59-66","[Kaczmarzyk D et al.]","KTH - Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden.",29199103,"10.1016/j.ymben.2017.11.014 ","Fatty alcohol production in Synechocystis sp. PCC 6803 was achieved through heterologous expression of the fatty acyl-CoA/ACP reductase Maqu2220 from the bacteria Marinobacter aquaeolei VT8 and the fatty acyl-ACP reductase DPW from the rice Oryza sativa. These platform strains became models for testing multiplex CRISPR-interference (CRISPRi) metabolic engineering strategies to both improve fatty alcohol production and to study membrane homeostasis. CRISPRi allowed partial repression of up to six genes simultaneously, each encoding enzymes of acyl-ACP-consuming pathways. We identified the essential phosphate acyltransferase enzyme PlsX (slr1510) as a key node in C18 fatty acyl-ACP consumption, repression of slr1510 increased octadecanol productivity threefold over the base strain and gave the highest specific titers reported for this host, 10.3mgg(-1) DCW. PlsX catalyzes the first committed step of phosphatidic acid synthesis, and has not been characterized in Synechocystis previously. We found that accumulation of fatty alcohols impaired growth, altered the membrane composition, and caused a build-up of reactive oxygen species.","rice","Synechocystissp。における脂肪アルコール産生 PCC 6803は、細菌Marinobacter aquaeoleiVT8からの脂肪アシルCoA / ACPレダクターゼMaqu2220と、イネOryzasativaからの脂肪アシルACPレダクターゼDPWの異種発現によって達成されました。これらのプラットフォーム株は、脂肪アルコール産生を改善し、膜の恒常性を研究するための多重CRISPR干渉（CRISPRi）代謝工学戦略をテストするためのモデルになりました。CRISPRiは、最大6つの遺伝子を同時に部分的に抑制し、それぞれがアシルACP消費経路の酵素をコードします。必須リン酸アシルトランスフェラーゼ酵素PlsX（slr1510）をC18脂肪アシル-ACP消費の重要なノードとして特定し、slr1510の抑制により、オクタデカノールの生産性が基本株の3倍に増加し、この宿主で報告されている最高の比価、10.3mgg（-1 ）DCW。PlsXは、ホスファチジン酸合成の最初のコミットされたステップを触媒し、以前はSynechocystisで特徴付けられていませんでした。脂肪アルコールの蓄積が成長を損ない、膜組成を変化させ、活性酸素種の蓄積を引き起こすことを発見しました。"]
[120,29269023,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","WUSCHEL homeobox2 (WOX2)-like (WOX2L)","Molecular plant","Rice Interploidy Crosses Disrupt Epigenetic Regulation, Gene Expression, and Seed Development.",2018,"11(2):300-314","[Wang L et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",29269023,"10.1016/j.molp.2017.12.006 ","Seed development in angiosperms requires a 2:1 maternal-to-paternal genome ratio  (2m:1p) in the endosperm. When the ratio is disrupted, the seed development is impaired. Rice interploidy crosses result in endosperm failures, but the underlying molecular mechanisms remain unclear. Here, we report that the defective endosperm in rice interploidy crosses was associated with nonadditive expression of small RNAs and protein-coding genes. Interestingly, 24-nt small interfering RNAs were enriched in the 5' and 3' flanking sequences of nonadditively expressed genes in the interploidy crosses and were negatively associated with the expression of imprinted genes. Furthermore, some PRC2 family  genes and DNA methylation-related genes including OsMET1b and OsCMT3a were upregulated in the 2x4 cross (pollinating a diploid \"mother\" with a tetraploid \"father\") but repressed in the reciprocal cross. These different epigenetic effects could lead to precocious or delayed cellularization during endosperm development. Notably, many endosperm-preferred genes, including starch metabolic  and storage protein genes during grain filling, were found to be associated with  DNA methylation or H3K27me3, which are repressed in both 2x4 and 4x2 crosses. WUSCHEL homeobox2 (WOX2)-like (WOX2L), an endosperm-preferred gene, was expressed specifically in the rice endosperm, in contrast to WOX2 expression in the Arabidopsis embryo. Disruption of WOX2L in transgenic rice by CRISPR/Cas9-mediated gene editing blocked starch and protein accumulation, resulting in seed abortion. In addition to gene repression, disrupting epigenetic process in the interploidy crosses also induced expression of stress-responsive genes. Thus, maintaining the 2m:1p genome ratio in the endosperm is essential for normal grain development in rice and other cereal crops.","rice","被子植物の種子の発達には、胚乳で2：1の母体と父体のゲノム比（2m：1p）が必要です。比率が乱れると、種子の発育が損なわれます。イネの倍数性交雑は胚乳の障害を引き起こしますが、根底にある分子メカニズムは不明なままです。ここでは、イネの倍数体間交雑における欠陥のある胚乳が、低分子RNAおよびタンパク質コード遺伝子の非相加的発現と関連していたことを報告します。興味深いことに、24 ntの小さな干渉RNAは、倍数体間交雑で非相加的に発現する遺伝子の5 'および3'隣接配列に富んでおり、インプリントされた遺伝子の発現と負の関連がありました。さらに、いくつかのPRC2ファミリー遺伝子とOsMET1bおよびOsCMT3aを含むDNAメチル化関連遺伝子は、2x4交配でアップレギュレートされましたが（2倍体「母」を4倍体「父」で受粉）、相互交配では抑制されました。これらの異なるエピジェネティック効果は、内胚葉の発達中に早熟または遅延細胞化につながる可能性があります。特に、穀物充填中のデンプン代謝および貯蔵タンパク質遺伝子を含む多くの内胚葉優先遺伝子は、2x4および4x2交配の両方で抑制されるDNAメチル化またはH3K27me3に関連していることがわかった。シロイヌナズナの胚におけるWOX2の発現とは対照的に、胚乳に好まれる遺伝子であるWUSCHEL homeobox2（WOX2）-like（WOX2L）は、イネの胚乳で特異的に発現しました。CRISPR / Cas9を介した遺伝子編集によるトランスジェニックイネのWOX2Lの破壊は、デンプンとタンパク質の蓄積をブロックし、種子の流産をもたらしました。遺伝子抑制に加えて、倍数体間交雑におけるエピジェネティックプロセスの破壊もストレス応答性遺伝子の発現を誘発した。したがって、内胚葉で2m：1pのゲノム比を維持することは、米や他の穀物作物の正常な穀物の発達に不可欠です。"]
[121,29795191,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","protein with four Armadillo repeats (Ptr)","Nature communications","The rice blast resistance gene Ptr encodes an atypical protein required for broad-spectrum disease resistance.",2018,"9(1):2039","[Zhao H et al.]","USDA ARS Dale Bumpers National Rice Research Center, Stuttgart, AR, USA.",29795191,"10.1038/s41467-018-04369-4 ","Plant resistance genes typically encode proteins with nucleotide binding site-leucine rich repeat (NLR) domains. Here we show that Ptr is an atypical resistance gene encoding a protein with four Armadillo repeats. Ptr is required for broad-spectrum blast resistance mediated by the NLR R gene Pi-ta and by the associated R gene Pi-ta2. Ptr is expressed constitutively and encodes two isoforms that are mainly localized in the cytoplasm. A two base pair deletion within the Ptr coding region in the fast neutron-generated mutant line M2354 creates a truncated protein, resulting in susceptibility to M. oryzae. Targeted mutation of Ptr in a resistant cultivar using CRISPR/Cas9 leads to blast susceptibility, further confirming its resistance function. The cloning of Ptr may aid in the development of broad spectrum blast resistant rice.","rice","植物耐性遺伝子は通常、ヌクレオチド結合部位-ロイシンリッチリピート（NLR）ドメインを持つタンパク質をコードします。ここでは、Ptrが4つのアルマジロリピートを持つタンパク質をコードする非定型の耐性遺伝子であることを示しています。Ptrは、NLRR遺伝子Pi-taおよび関連するR遺伝子Pi-ta2によって媒介される広域スペクトルの爆風耐性に必要です。Ptrは構成的に発現し、主に細胞質に局在する2つのアイソフォームをコードします。高速中性子生成変異株M2354のPtrコーディング領域内の2塩基対の欠失は、短縮型タンパク質を作成し、M。oryzaeに対する感受性をもたらします。CRISPR / Cas9を使用した耐性品種におけるPtrの標的突然変異は、芽球感受性をもたらし、その耐性機能をさらに確認します。Ptrのクローニングは、広範囲の耐爆風米の開発に役立つ可能性があります。"]
[122,29704881,"plant","rice","RdDM;","calnexin (CNX); protein disulphide isomerase (PDIL1-1); luminal binding protein (BiP1); endoplasmic reticulum stress-inducible gene (OsbZIP50); genes with seed-specific expression (alpha-globulin (Glb-1); glutelin-B4 (GluB4))","Plant biotechnology journal","Transgene-independent heredity of RdDM-mediated transcriptional gene silencing of endogenous genes in rice.",2018,"16(12):2007-2015","[Wakasa Y  et al.]","Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba, Japan.",29704881,"10.1111/pbi.12934 ","To induce transcriptional gene silencing (TGS) of endogenous genes of rice (Oryza sativa L.), we expressed double-strand RNA of each promoter region and thus induced RNA-directed DNA methylation (RdDM). We targeted constitutively expressed genes encoding calnexin (CNX), protein disulphide isomerase (PDIL1-1) and luminal binding protein (BiP1); an endoplasmic reticulum stress-inducible gene (OsbZIP50); and genes with seed-specific expression encoding alpha-globulin (Glb-1) and glutelin-B4 (GluB4). TGS of four genes was obtained with high efficiency (CNX, 66.7% of regenerated plants; OsBiP1, 67.4%; OsbZIP50, 63.4%; GluB4, 66.1%), whereas the efficiency was lower for PDIL1-1 (33.3%) and Glb-1 TGS lines (10.5%). The heredity of TGS, methylation levels of promoter regions and specificity of silencing of the target gene were investigated in some of the TGS  lines. In progeny of CNX and OsbZIP50 TGS lines, suppression of the target genes  was preserved (except in the endosperm) even after the removal of trigger genes (T-DNA) by segregation. TGS of CNX was reverted by demethylation treatment, and a significant difference in CG and CHG methylation levels in the -1 to -250 bp region of the CNX promoter was detected between the TGS and revertant lines, suggesting that TGS is closely related to the methylation levels of promoter. TGS exhibited specific suppression towards the target gene compared with post-transcriptional gene silencing when GluB4 gene from glutelin multigene family was targeted. Based on these results, future perspectives and problems to  be solved in the application of RdDM to new plant breeding techniques in rice are discussed.","rice","イネ（Oryza sativa L.）の内因性遺伝子の転写遺伝子サイレンシング（TGS）を誘導するために、各プロモーター領域の二本鎖RNAを発現させ、RNA指向性DNAメチル化（RdDM）を誘導しました。カルネキシン（CNX）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDIL1-1）、管腔結合タンパク質（BiP1）をコードする構成的に発現する遺伝子を標的としました。小胞体ストレス誘導性遺伝子（OsbZIP50）; アルファグロブリン（Glb-1）とグルテリン-B4（GluB4）をコードする種子特異的発現を持つ遺伝子。4つの遺伝子のTGSは高効率で得られました（CNX、再生植物の66.7％; OsBiP1、67.4％; OsbZIP50、63.4％; GluB4、66.1％）が、効率はPDIL1-1（33.3％）とGlb-で低かった。 1 TGSライン（10.5％）。TGSの遺伝性、プロモーター領域のメチル化レベル、および標的遺伝子のサイレンシングの特異性が、いくつかのTGS系統で調査されました。CNXおよびOsbZIP50TGS系統の子孫では、分離によってトリガー遺伝子（T-DNA）が除去された後でも、標的遺伝子の抑制が維持されていました（内胚葉を除く）。CNXのTGSは脱メチル化処理によって元に戻り、CNXプロモーターの-1〜-250 bp領域でCGおよびCHGのメチル化レベルに有意差が検出されました。これは、TGSがメチル化と密接に関連していることを示唆しています。プロモーターのレベル。TGSは、グルテリン多遺伝子ファミリーのGluB4遺伝子を標的とした場合、転写後遺伝子サイレンシングと比較して、標的遺伝子に対して特異的な抑制を示しました。これらの結果に基づいて、RdDMをイネの新しい植物育種技術に適用する際に解決すべき将来の展望と問題について議論します。"]
[123,29604159,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","initiation factor 4 gamma gene (eIF4G)","Plant biotechnology journal","Novel alleles of rice eIF4G generated by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis confer  resistance to Rice tungro spherical virus.",2018,"16(11):1918-1927","[Macovei A et al.]","International Rice Research Institute (IRRI), Metro Manila, Philippines.",29604159,"10.1111/pbi.12927 ","Rice tungro disease (RTD) is a serious constraint in rice production across tropical Asia. RTD is caused by the interaction between Rice tungro spherical virus (RTSV) and Rice tungro bacilliform virus. RTSV resistance found in traditional cultivars has contributed to a reduction in the incidence of RTD in the field. Natural RTSV resistance is a recessive trait controlled by the translation initiation factor 4 gamma gene (eIF4G). The Y(1059) V(1060) V(1061) residues of eIF4G are known to be associated with the reactions to RTSV. To develop new sources of resistance to RTD, mutations in eIF4G were generated using the CRISPR/Cas9 system in the RTSV-susceptible variety IR64, widely grown across  tropical Asia. The mutation rates ranged from 36.0% to 86.6%, depending on the target site, and the mutations were successfully transmitted to the next generations. Among various mutated eIF4G alleles examined, only those resulting in in-frame mutations in SVLFPNLAGKS residues (mainly NL), adjacent to the YVV residues, conferred resistance. Furthermore, our data suggest that eIF4G is essential for normal development, as alleles resulting in truncated eIF4G could not be maintained in homozygous state. The final products with RTSV resistance and enhanced yield under glasshouse conditions were found to no longer contain the Cas9 sequence. Hence, the RTSV-resistant plants with the novel eIF4G alleles  represent a valuable material to develop more diverse RTSV-resistant varieties.","rice","米ツングロ病（RTD）は、熱帯アジア全体の米生産における深刻な制約です。RTDは、Rice tungro球状ウイルス（RTSV）とRice tungrobacilliformウイルスの間の相互作用によって引き起こされます。従来の栽培品種に見られるRTSV耐性は、現場でのRTDの発生率の低下に貢献しています。自然なRTSV耐性は、翻訳開始因子4ガンマ遺伝子（eIF4G）によって制御される劣性形質です。eIF4GのY（1059）V（1060）V（1061）残基は、RTSVへの反応に関連していることが知られています。RTDに対する新しい耐性源を開発するために、熱帯アジアで広く栽培されているRTSV感受性品種IR64のCRISPR / Cas9システムを使用して、eIF4Gの変異を生成しました。変異率は標的部位にもよるが36.0％から86.6％の範囲であり、変異は次世代への伝達に成功した。調べたさまざまな変異eIF4G対立遺伝子の中で、YVV残基に隣接するSVLFPNLAGKS残基（主にNL）にインフレーム変異をもたらすものだけが耐性を付与しました。さらに、我々のデータは、eIF4Gが正常な発達に不可欠であることを示唆している。なぜなら、eIF4Gが切り詰められた対立遺伝子はホモ接合状態で維持できなかったからである。温室条件下でRTSV耐性があり、歩留まりが向上した最終製品には、Cas9シーケンスが含まれていないことがわかりました。したがって、新しいeIF4G対立遺伝子を持つRTSV耐性植物は、より多様なRTSV耐性品種を開発するための貴重な材料です。"]
[124,29479779,"plant","rice","CRISPR;","rice amino acid transporter (OsAAP3)","Plant biotechnology journal","Blocking amino acid transporter OsAAP3 improves grain yield by promoting outgrowth buds and increasing tiller number in rice.",2018,"16(10):1710-1722","[Lu K et al.]","Wuhan Institute of Bioengineering, Wuhan, China.",29479779,"10.1111/pbi.12907 ","Amino acid transporters (AATs) play indispensable roles in nutrient allocation during plant development. In this study, we demonstrated that inhibiting expression of the rice amino acid transporter OsAAP3 increased grain yield due to a formation of larger numbers of tillers as a result of increased bud outgrowth.  Elevated expression of OsAAP3 in transgenic plants resulted in significantly higher amino acid concentrations of Lys, Arg, His, Asp, Ala, Gln, Gly, Thr and Tyr, and inhibited bud outgrowth and rice tillering. However, RNAi of OsAAP3 decreased significantly Arg, Lys, Asp and Thr concentrations to a small extent, and thus promoted bud outgrowth, increased significantly tiller numbers and effective panicle numbers per plant, and further enhanced significantly grain yield and nitrogen use efficiency (NUE). The promoter sequences of OsAAP3 showed  some divergence between Japonica and Indica rice, and expression of the gene was  higher in Japonica, which produced fewer tillers than Indica. We generated knockout lines of OsAAP3 on Japonica ZH11 and KY131 using CRISPR technology and found that grain yield could be increased significantly. These results suggest that manipulation of OsAAP3 expression could be used to increase grain yield in rice.","rice","アミノ酸トランスポーター（AAT）は、植物の発育中の栄養素の配分に不可欠な役割を果たします。この研究では、米アミノ酸トランスポーターOsAAP3の発現を阻害すると、芽の成長が増加した結果、より多くの分げつが形成されるため、穀物の収量が増加することを示しました。トランスジェニック植物におけるOsAAP3の発現の上昇は、Lys、Arg、His、Asp、Ala、Gln、Gly、Thr、およびTyrの有意に高いアミノ酸濃度をもたらし、芽の成長と稲の分げつを抑制しました。ただし、OsAAP3のRNAiは、Arg、Lys、Asp、およびThrの濃度をわずかに低下させ、芽の成長を促進し、植物あたりの分げつ数と有効穂数を大幅に増加させ、穀物収量と窒素利用効率（NUE）をさらに向上させました。 。OsAAP3のプロモーター配列は、ジャポニカとインディカ米の間でいくらかの相違を示し、遺伝子の発現は、インディカよりも分げつが少ないジャポニカでより高かった。CRISPRテクノロジーを使用してJaponicaZH11とKY131でOsAAP3のノックアウトラインを生成し、穀物の収量が大幅に増加する可能性があることを発見しました。これらの結果は、OsAAP3発現の操作がイネの子実収量を増加させるために使用できることを示唆しています。"]
[125,28605576,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","sites containing NGA PAM","Plant biotechnology journal","Increasing the efficiency of CRISPR-Cas9-VQR precise genome editing in rice.",2018,"16(1):292-297","[Hu X et al.]","China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, China.",28605576,"10.1111/pbi.12771 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9 (CRISPR-Cas9) is a revolutionary technology that enables efficient genomic modification in many organisms. Currently, the wide use of Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) primarily recognizes sites harbouring a canonical NGG protospacer adjacent motif (PAM). The newly developed VQR (D1135V/R1335Q/T1337R) variant of Cas9 has been shown to cleave sites containing NGA PAM in rice, which greatly expanded the range of genome editing. However, the low editing efficiency of the  VQR variant remains, which limits its wide application in genome editing. In this study, by modifying the single guide RNA (sgRNA) structure and strong endogenous  promoters, we significantly increased the editing efficiency of the VQR variant.  The modified CRISPR-Cas9-VQR system provides a robust toolbox for multiplex genome editing at sites containing noncanonical NGA PAM.","rice","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート関連タンパク質9（CRISPR-Cas9）は、多くの生物で効率的なゲノム修飾を可能にする革新的な技術です。現在、Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）の幅広い使用は、主に標準的なNGGプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含むサイトを認識します。新しく開発されたCas9のVQR（D1135V / R1335Q / T1337R）バリアントは、米のNGA PAMを含むサイトを切断することが示され、ゲノム編集の範囲が大幅に拡大しました。ただし、VQRバリアントの編集効率は低いままであり、ゲノム編集での幅広いアプリケーションが制限されます。この研究では、シングルガイドRNA（sgRNA）構造と強力な内因性プロモーターを変更することにより、VQRバリアントの編集効率を大幅に向上させました。変更されたCRISPR-Cas9-VQRシステムは、非標準的なNGAPAMを含むサイトでのマルチプレックスゲノム編集のための堅牢なツールボックスを提供します。"]
[126,29572657,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","receptor-like cytoplasmic kinase LOC_Os03g24930 (OsBBS1)","Plant cell reports","A guanine insert in OsBBS1 leads to early leaf senescence and salt stress sensitivity in rice (Oryza sativa L.).",2018,"37(6):933-946","[Zeng DD et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",29572657,"10.1007/s00299-018-2280-y ","KEY MESSAGE: A rice receptor-like kinase gene OSBBS1/OsRLCK109 was identified; this gene played vital roles in leaf senescence and the salt stress response. Early leaf senescence can cause negative effects on rice yield, but the underlying molecular regulation is not fully understood. bilateral blade senescence 1 (bbs1), an early leaf senescence mutant with a premature senescence  phenotype that occurs mainly performing at the leaf margins, was isolated from a  rice mutant population generated by ethylmethane sulfonate (EMS) treatment. The mutant showed premature leaf senescence beginning at the tillering stage and exhibited severe symptoms at the late grain-filling stage. bbs1 showed accelerated dark-induced leaf senescence. The OsBBS1 gene was cloned by a map-based cloning strategy, and a guanine (G) insertion was found in the first exon of LOC_Os03g24930. This gene encodes a receptor-like cytoplasmic kinase and  was named OsRLCK109 in a previous study. Transgenic LOC_Os03g24930 knockout plants generated by a CRISPR/Cas9 strategy exhibited similar early leaf senescence phenotypes as did the bbs1 mutant, which confirmed that LOC_Os03g24930 was the OsBBS1 gene. OsBBS1/OsRLCK109 was expressed in all detected tissues and was predominantly expressed in the main vein region of mature leaves. The expression of OsBBS1 could be greatly induced by salt stress, and the bbs1 mutant exhibited hypersensitivity to salt stress. In conclusion, this is the first identification of OsRLCKs participating in leaf senescence and playing critical roles in the salt stress response in rice (Oryza sativa L.).","rice","重要なメッセージ：イネ受容体様キナーゼ遺伝子OSBBS1 / OsRLCK109が同定されました。この遺伝子は、葉の老化と塩分ストレス応答において重要な役割を果たしました。初期の葉の老化は米の収量に悪影響を与える可能性がありますが、根本的な分子調節は完全には理解されていません。両側ブレード老化1（bbs1）は、主に葉の縁で発生する時期尚早の老化表現型を持つ初期の葉老化変異体であり、エチルメタンスルホネート（EMS）処理によって生成された米変異体集団から分離されました。突然変異体は、分げつ期に始まる時期尚早の葉の老化を示し、後期の穀粒充填段階で重度の症状を示した。bbs1は、暗闇で誘発された葉の老化の加速を示した。OsBBS1遺伝子は、マップベースのクローニング戦略によってクローン化され、グアニン（G）の挿入がLOC_Os03g24930の最初のエキソンで見つかりました。この遺伝子は受容体様細胞質キナーゼをコードしており、以前の研究ではOsRLCK109と名付けられました。CRISPR / Cas9戦略によって生成されたトランスジェニックLOC_Os03g24930ノックアウト植物は、bbs1変異体と同様の初期葉老化表現型を示し、LOC_Os03g24930がOsBBS1遺伝子であることを確認しました。OsBBS1 / OsRLCK109は、検出されたすべての組織で発現し、主に成熟した葉の主静脈領域で発現しました。OsBBS1の発現は塩分ストレスによって大きく誘導される可能性があり、bbs1変異体は塩分ストレスに対して過敏性を示した。結論として、これは葉の老化に関与し、米（Oryza sativa L.）の塩ストレス応答に重要な役割を果たすOsRLCKの最初の同定です。"]
[127,29411094,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","plant-specific type III polyketide  synthase (OsPKS2)","Plant cell reports","OsPKS2 is required for rice male fertility by participating in pollen wall formation.",2018,"37(5):759-773","[Zou T et al.]","Sichuan Agricultural University, Chengdu, China.",29411094,"10.1007/s00299-018-2265-x ","KEY MESSAGE: OsPKS2, the rice orthologous gene of Arabidopsis PKSB/LAP5, encodes  a polyketide synthase that is involved in pollen wall formation in rice. In flowering plants, the pollen wall protects male gametes from various environmental stresses and pathogen attacks, as well as promotes pollen germination. The biosynthesis of sporopollenin in tapetal cell is critical for pollen wall formation. Recently, progress has been made in understanding sporopollenin metabolism during pollen wall development in Arabidopsis. However,  little is known about the molecular mechanism that underlies the sporopollenin synthesis in pollen wall formation in rice (Oryza sativa). In this study, we identified that a point mutation in OsPKS2, a plant-specific type III polyketide  synthase gene, caused male sterility in rice by affecting the normal progress of  pollen wall formation. Two other allelic mutants of OsPKS2 were generated using the CRISPR/Cas9 system and are also completely male sterile. This result thus further confirmed that OsPKS2 controls rice male fertility. We also showed that OsPKS2 is an orthologous gene of Arabidopsis PKSB/LAP5 and has a tapetum-specific expression pattern. In addition, its product localizes in the endoplasmic reticulum. Results suggested that OsPKS2 is critical for pollen wall formation, and plays a conserved but differentiated role in sporopollenin biosynthesis from  Arabidopsis.","rice","重要なメッセージ：Arabidopsis PKSB / LAP5の米オーソロガス遺伝子であるOsPKS2は、米の花粉壁形成に関与するポリケチドシンターゼをコードしています。開花植物では、花粉壁は男性の配偶子をさまざまな環境ストレスや病原体の攻撃から保護し、花粉の発芽を促進します。タペタル細胞におけるスポロポレニンの生合成は、花粉壁の形成に重要です。最近、シロイヌナズナの花粉壁発達時のスポロポレニン代謝の理解が進んでいます。しかし、米（Oryza sativa）の花粉壁形成におけるスポロポレニン合成の根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られていない。この研究では、植物特異的なタイプIIIポリケチドシンターゼ遺伝子であるOsPKS2の点変異が、花粉壁形成の正常な進行に影響を与えることにより、米の雄性不稔を引き起こすことを確認しました。OsPKS2の他の2つの対立遺伝子変異体は、CRISPR / Cas9システムを使用して生成され、完全に雄性不稔です。したがって、この結果は、OsPKS2がイネの雄の生殖能力を制御することをさらに確認しました。また、OsPKS2がシロイヌナズナPKSB / LAP5のオーソロガス遺伝子であり、タペータム特異的な発現パターンを持っていることも示しました。さらに、その製品は小胞体に局在します。結果は、OsPKS2が花粉壁形成に重要であり、Arabidopsisからのスポロポレニン生合成において保存されているが分化した役割を果たしていることを示唆しました。"]
[128,29890017,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","p-Coumaroyl ester 3-hydroxylase (C3'H)","Plant journal","Downregulation of p-COUMAROYL ESTER 3-HYDROXYLASE in rice leads to altered cell wall structures and improves biomass saccharification.",2018,null,"[Takeda Y et al.]","Kyoto University, Uji,  Kyoto, Japan.",29890017,"10.1111/tpj.13988 ","p-Coumaroyl ester 3-hydroxylase (C3'H) is a key enzyme involved in the biosynthesis of lignin, a phenylpropanoid polymer that is the major constituent of secondary cell walls in vascular plants. Although the crucial role of C3'H in  lignification and its manipulation to upgrade lignocellulose have been investigated in eudicots, limited information is available in monocotyledonous grass species, despite their potential as biomass feedstocks. Here we address the pronounced impacts of C3'H deficiency on the structure and properties of grass cell walls. C3'H-knockdown lines generated via RNA interference (RNAi)-mediated gene silencing, with about 0.5% of the residual expression levels, reached maturity and set seeds. In contrast, C3'H-knockout rice mutants generated via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis were severely dwarfed and sterile. Cell wall analysis of the mature C3'H-knockdown RNAi lines revealed that their lignins were largely enriched in p-hydroxyphenyl (H) units while being substantially reduced in the normally dominant guaiacyl (G) and syringyl (S) units. Interestingly, however, the enrichment of H units was limited to within the non-acylated lignin  units, with grass-specific gamma-p-coumaroylated lignin units remaining apparently unchanged. Suppression of C3'H also resulted in relative augmentation  in tricin residues in lignin as well as a substantial reduction in wall cross-linking ferulates. Collectively, our data demonstrate that C3'H expression  is an important determinant not only of lignin content and composition but also of the degree of cell wall cross-linking. We also demonstrated that C3'H-suppressed rice displays enhanced biomass saccharification.","rice","p-クマロイルエステル3-ヒドロキシラーゼ（C3'H）は、血管植物の二次細胞壁の主成分であるフェニルプロパノイドポリマーであるリグニンの生合成に関与する重要な酵素です。リグノセルロースをアップグレードするためのリグニン化とその操作におけるC3'Hの重要な役割が真正双子類で調査されましたが、バイオマス原料としての可能性にもかかわらず、単子葉植物種で利用できる情報は限られています。ここでは、草細胞壁の構造と特性に対するC3'H欠乏の顕著な影響について説明します。RNA干渉（RNAi）を介した遺伝子サイレンシングを介して生成されたC3'Hノックダウンラインは、残存発現レベルの約0.5％で成熟に達し、種をまきました。対照的に、CRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を介して生成されたC3'Hノックアウト米突然変異体は、ひどく矮小化され、無菌でした。成熟したC3'HノックダウンRNAi系統の細胞壁分析により、それらのリグニンはp-ヒドロキシフェニル（H）ユニットで大部分が濃縮され、通常は優勢なグアヤシル（G）およびシリンギル（S）ユニットで大幅に減少していることが明らかになりました。しかし、興味深いことに、Hユニットの濃縮は非アシル化リグニンユニット内に限定され、草特異的なガンマ-p-クマロイル化リグニンユニットは明らかに変化していませんでした。C3'Hの抑制はまた、リグニンのトリシン残基の相対的な増大、ならびに壁架橋フェレートの実質的な減少をもたらした。まとめると、私たちのデータは、C3'Hの発現が、リグニンの含有量と組成だけでなく、細胞壁の架橋の程度の重要な決定要因であることを示しています。また、C3'H抑制米が強化されたバイオマス糖化を示すことも実証しました。"]
[129,29735369,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","fatty acid desaturase 2 (OsFAD2-1)","Plant physiology and biochemistry","Production of high oleic/low linoleic rice by genome editing.",2018,"131:58-62","[Abe K et al.]","Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",29735369,"10.1016/j.plaphy.2018.04.033 ","Rice bran oil (RBO) contains many valuable healthy constituents, including oleic  acid. Improvement of the fatty acid composition in RBO, including an increase in  the content of oleic acid, which helps suppress lifestyle disease, would increase health benefits. The enzyme fatty acid desaturase 2 (FAD2) catalyzes the conversion of oleic acid to linoleic acid in plants, and FAD2 mutants exhibit altered oleic and linoleic acid content in many crops. There are three functional FAD2 genes in the genome of rice (Oryza sativa L.), and, of these, expression of  the OsFAD2-1 gene is highest in rice seeds. In order to produce high oleic/low linoleic RBO, we attempted to disrupt the OsFAD2-1 gene by CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis. We succeeded in the production of homozygous OsFAD2-1 knockout rice plants. The content of oleic acid increased to more than twice that of wild type, and, surprisingly, linoleic acid, a catabolite of oleic acid by FAD2, decreased dramatically to undetectable levels in fad2-1 mutant brown rice seeds. In this study, by genome editing based on genome information, we succeeded in the production of rice whose fatty acid composition is greatly improved. We suggest that CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of a major gene that shows dominant expression in the target tissue could be a powerful tool to improve target traits in a tissue-specific manner.","rice","米ぬか油（RBO）には、オレイン酸を含む多くの貴重な健康成分が含まれています。生活習慣病の抑制に役立つオレイン酸の含有量の増加を含む、RBOの脂肪酸組成の改善は、健康上の利益を増加させるでしょう。酵素脂肪酸デサチュラーゼ2（FAD2）は、植物のオレイン酸からリノール酸への変換を触媒し、FAD2変異体は、多くの作物でオレイン酸とリノール酸の含有量の変化を示します。イネ（Oryza sativa L.）のゲノムには3つの機能的なFAD2遺伝子があり、そのうちOsFAD2-1遺伝子の発現はイネの種子で最も高くなっています。高オレイン酸/低リノール酸RBOを生成するために、CRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発によってOsFAD2-1遺伝子を破壊しようとしました。ホモ接合型のOsFAD2-1ノックアウトイネの生産に成功しました。オレイン酸の含有量は野生型の2倍以上に増加し、驚くべきことに、FAD2によるオレイン酸の異化代謝産物であるリノール酸は、fad2-1変異玄米種子で検出できないレベルまで劇的に減少しました。本研究では、ゲノム情報に基づくゲノム編集により、脂肪酸組成を大幅に改善した米の製造に成功しました。標的組織で優勢な発現を示す主要な遺伝子のCRISPR / Cas9を介した突然変異誘発は、組織特異的な方法で標的形質を改善するための強力なツールである可能性があることを示唆しています。"]
[130,30466580,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","POLYKETIDE SYNTHASE 1 (OsPKS1)","Plant science","OsPKS1 is required for sexine layer formation, which shows functional conservation between rice and Arabidopsis.",2018,"277:145-154","[Shi QS et al.]","Shanghai Normal University, Shanghai, China.",30466580,"10.1016/j.plantsci.2018.08.009 ","The sporopollenin precursors, as a general constituent of sexine, are synthesized in the tapetum and deposited on the pollen surface after transportation and processing. The polyketide synthase condenses the acyl-CoA into a hydroxyalkyl alpha-pyrone, which is predicted to be a component of the sporopollenin precursors. In this study, we found that the rice POLYKETIDE SYNTHASE 1 (OsPKS1)  was the orthologue of Arabidopsis POLYKETIDE SYNTHASE A/LESS ADHESIVE POLLEN 6 (PKSA/LAP6) through sequence alignment. The OsPKS1 knockout mutants obtained by Crispr-Cas9-mediated editing exhibited a complete male sterile phenotype. Cytological observations revealed that abnormal bacula deposition and ubisch body structures for sexine formation led to pollen rupture in ospks1. The expression analysis showed that the OsPKS1 was highly expressed in tapetal cells and anther  locules from stage 9 to stage 11 during anther development in rice. Subcellular localization demonstrated that the OsPKS1 protein was preferentially localized to the ER. The genomic sequence of OsPKS1 driven by the PKSA/LAP6 promoter restored  the sexine pattern of Arabidopsis pksa/lap6. These results indicated that OsPKS1  is required for sexine layer formation in rice and functionally conserved in the  sporopollenin synthesis pathway.","rice","セクシンの一般的な構成要素としてのスポロポレニン前駆体は、タペタムで合成され、輸送および処理後に花粉表面に沈着する。ポリケチドシンターゼは、アシル-CoAをヒドロキシアルキルα-ピロンに凝縮します。これは、スポロポレニン前駆体の成分であると予測されています。この研究では、米のPOLYKETIDE SYNTHASE 1（OsPKS1）が、配列アラインメントを通じて、Arabidopsis POLYKETIDE SYNTHASE A / LESS ADHESIVE POLLEN 6（PKSA / LAP6）のオルソログであることがわかりました。Crispr-Cas9を介した編集によって得られたOsPKS1ノックアウト変異体は、完全な男性の無菌表現型を示しました。細胞学的観察により、セクシン形成のための異常なバキュラ沈着とユビッシュ体構造がospks1で花粉破裂を引き起こしたことが明らかになった。発現解析により、OsPKS1は、イネの葯の発育中に、ステージ9からステージ11までのタペタル細胞および葯小塊で高度に発現されたことが示された。細胞内局在は、OsPKS1タンパク質が優先的にERに局在することを示した。PKSA / LAP6プロモーターによって駆動されるOsPKS1のゲノム配列は、シロイヌナズナpksa / lap6のセクシンパターンを復元しました。これらの結果は、OsPKS1がイネのセクシン層形成に必要であり、スポロポレニン合成経路で機能的に保存されていることを示しています。"]
[131,29362095,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","heat-sensitive albino1 (hsa1) ","Plant science","The newly identified heat-stress sensitive albino 1 gene affects chloroplast development in rice.",2018,"267:168-179","[Qiu Z et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",29362095,"10.1016/j.plantsci.2017.11.015 ","High temperature, a major abiotic stress, significantly affects the yield and quality of crops in many parts of the world. Components of the photosynthetic apparatus are highly susceptible to thermal damage. Although the responses to acute heat stress have been studied intensively, the mechanisms that regulate chloroplast development under heat stress remain obscure, especially in crop plants. Here, we cloned and characterized the gene responsible for the heat-sensitive albino1 (hsa1) mutation in rice (Oryza sativa). The hsa1 mutant harbors a recessive mutation in a gene encoding fructokinase-like protein2 (FLN2); the mutation causes a premature stop codon and results in a severe albino phenotype, with defects in early chloroplast development. The color of hsa1 mutant plants gradually changed from albino to green at later stages of development at various temperatures and chloroplast biogenesis was strongly delayed at high temperature (32 degrees C). HSA1 expression was strongly reduced  in hsa1 plants compared to wild type (WT). HSA1 localizes to the chloroplast and  regulates chloroplast development. An HSA1 deletion mutant induced by CRISPR/Cas9 was heat sensitive but had a faster greening phenotype than the original hsa1 allele at all temperatures. RNA and protein levels of plastid-encoded RNA polymerase-dependent plastid genes were markedly reduced in hsa1 plants compared  to WT. These results demonstrated that HSA1 plays important roles in chloroplast  development at early stages, and functions in protecting chloroplasts under heat  stress at later stages in rice.","rice","主要な非生物的ストレスである高温は、世界の多くの地域で作物の収量と品質に大きな影響を与えます。光合成装置のコンポーネントは、熱による損傷を受けやすいです。急性熱ストレスへの応答は集中的に研究されてきましたが、熱ストレス下での葉緑体の発達を調節するメカニズムは、特に作物では不明なままです。ここでは、米（Oryza sativa）の熱感受性albino1（hsa1）変異の原因となる遺伝子をクローン化して特性評価しました。hsa1変異体は、フルクトキナーゼ様タンパク質2（FLN2）をコードする遺伝子に劣性変異を持っています。突然変異は時期尚早の停止コドンを引き起こし、初期の葉緑体発達の欠陥を伴う重度のアルビノ表現型をもたらします。hsa1変異体植物の色は、さまざまな温度で発達の後期にアルビノから緑色に徐々に変化し、葉緑体の生合成は高温（32℃）で強く遅延しました。HSA1の発現は、野生型（WT）と比較してhsa1植物で強く減少しました。HSA1は葉緑体に局在し、葉緑体の発達を調節します。CRISPR / Cas9によって誘発されたHSA1欠失変異体は熱感受性でしたが、すべての温度で元のhsa1対立遺伝子よりも速い緑化表現型を持っていました。色素体にコードされたRNAポリメラーゼ依存性色素体遺伝子のRNAおよびタンパク質レベルは、WTと比較してhsa1植物で著しく減少しました。これらの結果は、HSA1が初期段階で葉緑体の発達に重要な役割を果たし、米の後期段階で熱ストレス下で葉緑体を保護する機能を果たしていることを示しています。"]
[132,30586438,"plant","rice","TALENs;","translational enhancer dMac3; iPromotor","PloS one","Establishment of a conditional TALEN system using the translational enhancer dMac3 and an inducible promoter activated by glucocorticoid treatment to increase the frequency of targeted mutagenesis in plants.",2018,"13(12):e0208959","[Onodera H et al.]","Tokyo University of Science, Tokyo, Japan.",30586438,"10.1371/journal.pone.0208959 ","Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) is an artificial nuclease  that causes DNA cleavage at the target site and induces few off-target reactions  because of its high sequence specificity. Powerful and variable tools using TALENs can be used in practical applications and may facilitate the molecular breeding of many plant species. We have developed a convenient construction system for a plant TALEN vector named the Emerald Gateway TALEN system. In this study, we added new properties to this system, which led to an increase in the efficiency of targeted mutagenesis. Rice dMac3 is a translational enhancer that highly increases the efficiency of translation of the downstream ORF. We inserted dMac3 into the 5' untranslated region of the TALEN gene. In the cultured rice cells to which the TALEN gene was introduced, the frequency of targeted mutagenesis was highly increased compared with those altered using the conventional system. Next, the promoter for the TALEN gene was replaced with iPromoter, and its expression was stringently controlled by a GVG transcription factor that was activated in the presence of glucocorticoid. This conditional expression system worked effectively and led to a higher frequency of targeted mutagenesis than that by the constitutive expression system, while no mutagenesis was detected without glucocorticoid treatment. These results suggest that our system can be applied to genome editing to create the desired mutation.","rice","転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、標的部位でDNA切断を引き起こし、その高い配列特異性のために標的外反応をほとんど誘発しない人工ヌクレアーゼです。TALENを使用した強力で可変のツールは、実際のアプリケーションで使用でき、多くの植物種の分子育種を促進する可能性があります。エメラルドゲートウェイTALENシステムと呼ばれるプラントTALENベクターの便利な構築システムを開発しました。この研究では、このシステムに新しいプロパティを追加しました。これにより、標的変異誘発の効率が向上しました。ライスdMac3は、下流のORFの翻訳効率を大幅に向上させるトランスレーショナルエンハンサーです。TALEN遺伝子の5 '非翻訳領域にdMac3を挿入しました。TALEN遺伝子が導入された培養米細胞では、従来のシステムを用いて改変されたものと比較して、標的突然変異誘発の頻度が非常に増加した。次に、TALEN遺伝子のプロモーターをiPromoterに置き換え、糖質コルチコイドの存在下で活性化されたGVG転写因子によってその発現を厳密に制御しました。この条件付き発現システムは効果的に機能し、構成的発現システムよりも標的変異誘発の頻度が高くなりましたが、グルココルチコイド処理なしでは変異誘発は検出されませんでした。これらの結果は、私たちのシステムをゲノム編集に適用して、目的の変異を作成できることを示唆しています。"]
[133,30037991,"plant","rice","CRISPR;Cas9"," ","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Identifying a large number of high-yield genes in rice by pedigree analysis, whole-genome sequencing, and CRISPR-Cas9 gene knockout.",2018,"115(32):E7559-E7567","[Huang J et al.]","Nanjing University, Nanjing, China.",30037991,"10.1073/pnas.1806110115 ","Repeated artificial selection of a complex trait facilitates the identification of genes underlying the trait, especially if multiple selected descendant lines are available. Here we developed a pedigree-based approach to identify genes underlying the Green Revolution (GR) phenotype. From a pedigree analysis, we selected 30 cultivars including the \"miracle rice\" IR8, a GR landmark, its ancestors and descendants, and also other related cultivars for identifying high-yield genes. Through sequencing of these genomes, we identified 28 ancestral chromosomal blocks that were maintained in all the high-yield cultivars under study. In these blocks, we identified six genes of known function, including the  GR gene sd1, and 123 loci with genes of unknown function. We randomly selected 57 genes from the 123 loci for knockout or knockdown studies and found that a high proportion of these genes are essential or have phenotypic effects related to rice production. Notably, knockout lines have significant changes in plant height (P < 0.003), a key GR trait, compared with wild-type lines. Some gene knockouts or knockdowns were especially interesting. For example, knockout of Os10g0555100, a putative glucosyltransferase gene, showed both reduced growth and altered panicle architecture. In addition, we found that in some retained chromosome blocks several GR-related genes were clustered, although they have unrelated sequences, suggesting clustering of genes with similar functions. In conclusion,  we have identified many high-yield genes in rice. Our method provides a powerful  means to identify genes associated with a specific trait.","rice","複雑な形質の繰り返しの人工的な選択は、特に複数の選択された子孫系統が利用可能である場合、形質の根底にある遺伝子の同定を容易にします。ここでは、血統ベースのアプローチを開発して、グリーンレボリューション（GR）表現型の根底にある遺伝子を特定しました。血統分析から、GRのランドマークである「ミラクルライス」IR8、その祖先と子孫を含む30の栽培品種、および高収量遺伝子を同定するための他の関連栽培品種を選択しました。これらのゲノムの配列決定を通じて、研究中のすべての高収量栽培品種で維持されていた28の祖先染色体ブロックを特定しました。これらのブロックでは、GR遺伝子sd1を含む既知の機能の6つの遺伝子と、未知の機能の遺伝子を持つ123の遺伝子座を特定しました。ノックアウトまたはノックダウン研究のために123の遺伝子座から57の遺伝子をランダムに選択し、これらの遺伝子の高い割合が必須であるか、米の生産に関連する表現型の影響があることを発見しました。特に、ノックアウトラインは、野生型ラインと比較して、重要なGR特性である草丈に大きな変化があります（P <0.003）。いくつかの遺伝子ノックアウトまたはノックダウンは特に興味深いものでした。たとえば、推定されるグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるOs10g0555100のノックアウトは、成長の低下と穂の構造の変化の両方を示しました。さらに、いくつかの保持された染色体ブロックでは、いくつかのGR関連遺伝子がクラスター化されていることがわかりましたが、それらは無関係の配列を持っており、同様の機能を持つ遺伝子のクラスター化を示唆しています。結論として、我々は米の多くの高収量遺伝子を同定した。私たちの方法は、特定の特性に関連する遺伝子を識別するための強力な手段を提供します。"]
[134,29784797,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","group I (PYL1-PYL6; PYL12) and group II (PYL7-PYL11; PYL13) pyrabactin resistance 1-like (PYL) genes","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Mutations in a subfamily of abscisic acid receptor genes promote rice growth and  productivity.",2018,"115(23):6058-6063","[Miao C et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",29784797,"10.1073/pnas.1804774115 ","Abscisic acid (ABA) is a key phytohormone that controls plant growth and stress responses. It is sensed by the pyrabactin resistance 1 (PYR1)/PYR1-like (PYL)/regulatory components of the ABA receptor (RCAR) family of proteins. Here,  we utilized CRISPR/Cas9 technology to edit group I (PYL1-PYL6 and PYL12) and group II (PYL7-PYL11 and PYL13) PYL genes in rice. Characterization of the combinatorial mutants suggested that genes in group I have more important roles in stomatal movement, seed dormancy, and growth regulation than those in group II. Among all of the single pyl mutants, only pyl1 and pyl12 exhibited significant defects in seed dormancy. Interestingly, high-order group I mutants,  but not any group II mutants, displayed enhanced growth. Among group I mutants, pyl1/4/6 exhibited the best growth and improved grain productivity in natural paddy field conditions, while maintaining nearly normal seed dormancy. Our results suggest that a subfamily of rice PYLs has evolved to have particularly important roles in regulating plant growth and reveal a genetic strategy to improve rice productivity.","rice","アブシジン酸（ABA）は、植物の成長とストレス応答を制御する重要な植物ホルモンです。これは、ピラバクチン耐性1（PYR1）/ PYR1様（PYL）/ ABA受容体（RCAR）ファミリーのタンパク質の調節成分によって感知されます。ここでは、CRISPR / Cas9テクノロジーを利用して、イネのグループI（PYL1-PYL6およびPYL12）およびグループII（PYL7-PYL11およびPYL13）のPYL遺伝子を編集しました。コンビナトリアル変異体の特徴は、グループIの遺伝子が、グループIIの遺伝子よりも気孔の動き、種子の休眠、および成長調節においてより重要な役割を果たしていることを示唆しました。すべての単一pyl変異体の中で、pyl1とpyl12のみが種子休眠に重大な欠陥を示しました。興味深いことに、高次のグループI変異体は、グループII変異体ではなく、増強された成長を示しました。グループIの変異体の中で、pyl1 / 4/6は、ほぼ正常な種子の休眠状態を維持しながら、自然の水田条件で最高の成長と改善された穀物生産性を示しました。私たちの結果は、イネPYLのサブファミリーが進化して、植物の成長を調節する上で特に重要な役割を果たし、イネの生産性を向上させる遺伝的戦略を明らかにしていることを示唆しています。"]
[135,29855737,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","NAC family transcription factor (OsSND2)","Rice","OsSND2, a NAC family transcription factor, is involved in secondary cell wall biosynthesis through regulating MYBs expression in rice.",2018,"11(1):36","[Ye Y et al.]","Hefei Institutes of  Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei, Anhui, China.",29855737,"10.1186/s12284-018-0228-z ","BACKGROUND: As one of the most important staple food crops, rice produces huge agronomic biomass residues that contain lots of secondary cell walls (SCWs) comprising cellulose, hemicelluloses and lignin. The transcriptional regulation mechanism underlying SCWs biosynthesis remains elusive. RESULTS: In this study, we isolated a NAC family transcription factor (TF), OsSND2 through yeast one-hybrid screening using the secondary wall NAC-binding element (SNBE) on the promoter region of OsMYB61 which is known transcription factor for regulation of  SCWs biosynthesis as bait. We used an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and chromatin immunoprecipitation analysis (ChIP) to further confirm that OsSND2  can directly bind to the promoter of OsMYB61 both in vitro and in vivo. OsSND2, a close homolog of AtSND2, is localized in the nucleus and has transcriptional activation activity. Expression pattern analysis indicated that OsSND2 was mainly expressed in internodes and panicles. Overexpression of OsSND2 resulted in rolled leaf, increased cellulose content and up-regulated expression of SCWs related genes. The knockout of OsSND2 using CRISPR/Cas9 system decreased cellulose content and down-regulated the expression of SCWs related genes. Furthermore, OsSND2 can also directly bind to the promoters of other MYB family TFs by transactivation analysis in yeast cells and rice protoplasts. Altogether, our findings suggest that OsSND2 may function as a master regulator to mediate SCWs biosynthesis. CONCLUSION: OsSND2 was identified as a positive regulator of cellulose biosynthesis in rice. An increase in the expression level of this gene  can improve the SCWs cellulose content. Therefore, the study of the function of OsSND2 can provide a strategy for manipulating plant biomass production.","rice","背景：最も重要な主食作物の1つとして、米は、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを含む多くの二次細胞壁（SCW）を含む巨大な農業バイオマス残留物を生成します。SCWの生合成の根底にある転写調節メカニズムはとらえどころのないままです。結果：この研究では、SCWの調節のための既知の転写因子であるOsMYB61のプロモーター領域上の二次壁NAC結合要素（SNBE）を使用した酵母ワンハイブリッドスクリーニングにより、NACファミリー転写因子（TF）、OsSND2を単離しました。餌としての生合成。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）とクロマチン免疫沈降分析（ChIP）を使用して、OsSND2がinvitroおよびinvivoの両方でOsMYB61のプロモーターに直接結合できることをさらに確認しました。AtSND2の密接なホモログであるOsSND2は核に局在し、転写活性化活性を持っています。発現パターン分析は、OsSND2が主に節間および穂で発現されたことを示した。OsSND2の過剰発現は、葉を丸め、セルロース含有量を増加させ、SCW関連遺伝子の発現をアップレギュレートしました。CRISPR / Cas9システムを使用したOsSND2のノックアウトは、セルロース含有量を減少させ、SCW関連遺伝子の発現をダウンレギュレートしました。さらに、OsSND2は、酵母細胞およびイネのプロトプラストにおけるトランス活性化分析により、他のMYBファミリーTFのプロモーターに直接結合することもできます。要するに、我々の発見は、OsSND2がSCWの生合成を媒介するマスターレギュレーターとして機能する可能性があることを示唆している。結論：OsSND2は、米のセルロース生合成の正の調節因子として同定されました。この遺伝子の発現レベルの増加は、SCWのセルロース含有量を改善することができます。したがって、OsSND2の機能の研究は、植物バイオマス生産を操作するための戦略を提供することができます。"]
[136,29687350,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","gene encoding glycerohposphoryl diester phosphodiesterase","Rice","Genome-wide analyses of late pollen-preferred genes conserved in various rice cultivars and functional identification of a gene involved in the key processes of late pollen development.",2018,"11(1):28","[Moon S et al.]","Kyung Hee University, Yongin, Korea.",29687350,"10.1186/s12284-018-0219-0 ","BACKGROUND: Understanding late pollen development, including the maturation and pollination process, is a key component in maintaining crop yields. Transcriptome data obtained through microarray or RNA-seq technologies can provide useful insight into those developmental processes. Six series of microarray data from a  public transcriptome database, the Gene Expression Omnibus of the National Center for Biotechnology Information, are related to anther and pollen development. RESULTS: We performed a systematic and functional study across the rice genome of genes that are preferentially expressed in the late stages of pollen development, including maturation and germination. By comparing the transcriptomes of sporophytes and male gametes over time, we identified 627 late pollen-preferred genes that are conserved among japonica and indica rice cultivars. Functional classification analysis with a MapMan tool kit revealed a significant association between cell wall organization/metabolism and mature pollen grains. Comparative analysis of rice and Arabidopsis demonstrated that genes involved in cell wall modifications and the metabolism of major carbohydrates are unique to rice. We used the GUS reporter system to monitor the expression of eight of those genes. In addition, we evaluated the significance of our candidate genes, using T-DNA insertional mutant population and the CRISPR/Cas9 system. Mutants from T-DNA insertion and CRISPR/Cas9 systems of a rice gene encoding glycerophosphoryl diester phosphodiesterase are defective in their male gamete transfer. CONCLUSION: Through the global analyses of the late pollen-preferred genes from rice, we found several biological features of these genes. First, biological process related to cell wall organization and modification is over-represented in these genes to support rapid tube growth. Second, comparative analysis of late pollen preferred genes between rice and Arabidopsis provide a significant insight on the evolutional disparateness in cell wall biogenesis and storage reserves of  pollen. In addition, these candidates might be useful targets for future examinations of late pollen development, and will be a valuable resource for accelerating the understanding of molecular mechanisms for pollen maturation and  germination processes in rice.","rice","背景：成熟および受粉プロセスを含む後期花粉発達を理解することは、作物の収量を維持する上で重要な要素です。マイクロアレイまたはRNA-seqテクノロジーを通じて得られたトランスクリプトームデータは、これらの発達過程への有用な洞察を提供することができます。パブリックトランスクリプトームデータベース、国立バイオテクノロジー情報センターの遺伝子発現オムニバスからの6つの一連のマイクロアレイデータは、葯と花粉の発達に関連しています。結果：成熟や発芽を含む花粉発達の後期段階で優先的に発現する遺伝子のイネゲノム全体で体系的かつ機能的な研究を実施しました。スポロファイトとオスの配偶子のトランスクリプトームを経時的に比較することにより、ジャポニカとインディカの米の栽培者の間で保存されている627の後期花粉優先遺伝子を特定しました。MapManツールキットを使用した機能分類分析により、細胞壁の組織化/代謝と成熟した花粉粒との間に有意な関連があることが明らかになりました。イネとシロイヌナズナの比較分析は、細胞壁の修飾と主要な炭水化物の代謝に関与する遺伝子がイネに特有であることを示しました。GUSレポーターシステムを使用して、これらの遺伝子のうち8つの発現を監視しました。さらに、T-DNA挿入変異体集団とCRISPR / Cas9システムを使用して、候補遺伝子の重要性を評価しました。グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼをコードする米遺伝子のT-DNA挿入およびCRISPR / Cas9システムからの変異体は、雄性配偶子母体転移に欠陥があります。結論：米からの後期花粉優先遺伝子のグローバル分析を通じて、これらの遺伝子のいくつかの生物学的特徴を発見しました。第一に、細胞壁の組織化と修飾に関連する生物学的プロセスは、これらの遺伝子で過剰に表され、急速な管の成長をサポートします。第二に、イネとシロイヌナズナの間の後期花粉優先遺伝子の比較分析は、細胞壁生合成と花粉の貯蔵貯蔵における進化的不一致に関する重要な洞察を提供します。さらに、これらの候補は、後期花粉発達の将来の検査のための有用なターゲットである可能性があり、イネの花粉成熟および発芽プロセスの分子メカニズムの理解を加速するための貴重なリソースになります。"]
[137,29218376,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Ghd7.1","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","Genetic dissection and validation of candidate genes for flag leaf size in rice (Oryza sativa L.).",2018,"131(4):801-815","[Tang X et al.]","National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan, China.",29218376,"10.1007/s00122-017-3036-8 ","KEY MESSAGE: Two major loci with functional candidate genes were identified and validated affecting flag leaf size, which offer desirable genes to improve leaf architecture and photosynthetic capacity in rice. Leaf size is a major determinant of plant architecture and yield potential in crops. However, the genetic and molecular mechanisms regulating leaf size remain largely elusive. In  this study, quantitative trait loci (QTLs) for flag leaf length and flag leaf width in rice were detected with high-density single nucleotide polymorphism genotyping of a chromosomal segment substitution line (CSSL) population, in which each line carries one or a few chromosomal segments from the japonica cultivar Nipponbare in a common background of the indica variety Zhenshan 97. In total, 14 QTLs for flag leaf length and nine QTLs for flag leaf width were identified in the CSSL population. Among them, qFW4-2 for flag leaf width was mapped to a 37-kb interval, with the most likely candidate gene being the previously characterized  NAL1. Another major QTL for both flag leaf width and length was delimited by substitution mapping to a small region of 13.5 kb that contains a single gene, Ghd7.1. Mutants of Ghd7.1 generated using CRISPR/CAS9 approach showed reduced leaf size. Allelic variation analyses also validated Ghd7.1 as a functional candidate gene for leaf size, photosynthetic capacity and other yield-related traits. These results provide useful genetic information for the improvement of leaf size and yield in rice breeding programs.","rice","重要なメッセージ：機能的な候補遺伝子を持つ2つの主要な遺伝子座が特定され、旗葉のサイズに影響を与えることが検証されました。これらは、米の葉の構造と光合成能力を改善するための望ましい遺伝子を提供します。葉のサイズは、植物の構造と作物の収穫量の主要な決定要因です。ただし、葉のサイズを調節する遺伝的および分子的メカニズムは、ほとんどとらえどころのないままです。この研究では、イネの旗葉長と旗葉幅の量的形質遺伝子座（QTL）が、染色体セグメント置換系統（CSSL）集団の高密度一塩基多型ジェノタイピングで検出されました。インディカ品種Zhenshan97の共通の背景にあるジャポニカ栽培品種Nipponbareからの染色体セグメント。合計で、旗葉の長さの14のQTLと旗の葉の幅の9つのQTLがCSSL集団で同定されました。それらの中で、旗葉幅のqFW4-2は37 kb間隔にマッピングされ、最も可能性の高い候補遺伝子は以前に特徴付けられたNAL1でした。旗葉の幅と長さの両方に関する別の主要なQTLは、単一の遺伝子Ghd7.1を含む13.5kbの小さな領域への置換マッピングによって区切られました。CRISPR / CAS9アプローチを使用して生成されたGhd7.1の変異体は、葉のサイズの減少を示しました。対立遺伝子変異分析はまた、Ghd7.1が葉のサイズ、光合成能力、およびその他の収量に関連する形質の機能的な候補遺伝子であることを検証しました。これらの結果は、イネ育種プログラムにおける葉のサイズと収量の改善に役立つ遺伝情報を提供します。"]
[138,30099722,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","cytosolic glucose-1-phosphate adenylyl transferase large subunit (OsAPL2)","Transgenic research","CRISPR/Cas9-induced monoallelic mutations in the cytosolic AGPase large subunit gene APL2 induce the ectopic expression of APL2 and the corresponding small subunit gene APS2b in rice leaves.",2018,"27(5):423-439","[Perez L et al.]","University of Lleida-Agrotecnio Center, Lleida, Spain.",30099722,"10.1007/s11248-018-0089-7 ","The first committed step in the endosperm starch biosynthetic pathway is catalyzed by the cytosolic glucose-1-phosphate adenylyl transferase (AGPase) comprising large and small subunits encoded by the OsAPL2 and OsAPS2b genes, respectively. OsAPL2 is expressed solely in the endosperm so we hypothesized that mutating this gene would block starch biosynthesis in the endosperm without affecting the leaves. We used CRISPR/Cas9 to create two heterozygous mutants, one with a severely truncated and nonfunctional AGPase and the other with a C-terminal structural modification causing a partial loss of activity. Unexpectedly, we observed starch depletion in the leaves of both mutants and a corresponding increase in the level of soluble sugars. This reflected the unanticipated expression of both OsAPL2 and OsAPS2b in the leaves, generating a complete ectopic AGPase in the leaf cytosol, and a corresponding decrease in the  expression of the plastidial small subunit OsAPS2a that was only partially complemented by an increase in the expression of OsAPS1. The new cytosolic AGPase was not sufficient to compensate for the loss of plastidial AGPase, most likely because there is no wider starch biosynthesis pathway in the leaf cytosol and because pathway intermediates are not shuttled between the two compartments.","rice","内胚葉デンプン生合成経路の最初のコミットされたステップは、それぞれOsAPL2およびOsAPS2b遺伝子によってコードされる大小のサブユニットを含むサイトゾルグルコース-1-リン酸アデニリルトランスフェラーゼ（AGPase）によって触媒されます。OsAPL2は胚乳でのみ発現するため、この遺伝子を変異させると、葉に影響を与えることなく胚乳でのデンプン生合成が阻害されると仮定しました。CRISPR / Cas9を使用して、2つのヘテロ接合変異体を作成しました。1つはひどく切り詰められた機能しないAGPaseで、もう1つはC末端の構造が変更されて部分的に活性が失われています。予期せぬことに、我々は両方の変異体の葉でデンプンの枯渇とそれに対応する可溶性糖のレベルの増加を観察しました。これは、葉でのOsAPL2とOsAPS2bの両方の予期しない発現を反映しており、葉のサイトゾルで完全な異所性AGPaseを生成し、それに対応して、OsAPS1の発現の増加によって部分的にのみ補完されたプラスチド小サブユニットOsAPS2aの発現が減少しました。 。新しい細胞質ゾルAGPaseは、色素体AGPaseの喪失を補うのに十分ではありませんでした。おそらく、葉の細胞質ゾルにはより広いデンプン生合成経路がなく、経路中間体が2つの区画間を往復しないためです。"]
[139,30559100,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","narrow leaf 1; glossy1","Yi chuan = Hereditas","[Cas9 protein variant VQR recognizes NGAC protospacer adjacent motif in rice].",2018,"40(12):1112-1119","[Xin GW et al.]","Shanxi Agricultural University, Taigu, China.",30559100,"10.16288/j.yczz.18-126 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is the third-generation genome editing tools that  was developed and widely used in recent years. However, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) in this system could only recognize NGG PAM (protospacer adjacent motif), which largely restricts the range of genome editing. The VQR (D1135V/R1335Q/T1337R) variant of SpCas9 could recognize NGAA, NGAG and NGAT PAMs in rice. However, whether VQR variant could recognize NGAC PAM remains unclear. In this study, three low editing efficiency sites of the VQR variant, NAL1-Q1, NAL1-Q2 and LPA1-Q, were selected for genome editing using the improved CRISPR/VQR system. The improved CRISPR/VQR system effectively edited these target sites, and the gene editing efficiency was 9.75%, 43.90% and 29.26% respectively. To ensure the recognition of NGAC PAM by the improved CRISPR/VQR system, two NGAC PAM containing sites (NAL-C and GL1-C) in the NARROW LEAF 1 (NAL1) for leaf length and GLOSSY1 (GL1) genes for wax biosynthesis were selected for genome editing in rice in this study, and 57 transgenic plants were obtained. The PCR amplification and sequencing results showed that 27 plants (47.36%) had mutation  in the NAL1-C site, 44 plants (77.19%) had mutation in the GL1 gene, and 26 plants (45.61%) had mutation in the NAL-C and GL1-C sites. Further analysis revealed that there were four types of mutations caused by the CRISPR/VQR system, respectively for the hybrid mutation, biallelic mutation, chimeric mutation and homozygous mutations. Among them, heterozygous mutation and biallelic mutation were dominant changes. These results indicated that the improved CRISPR/VQR system could efficiently edit the NGAC PAM sites of the rice and produce abundant mutant types. This study provides a theoretical basis for NGAC PAM editing in rice and other related plants.","rice","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、近年開発され広く使用されている第3世代のゲノム編集ツールです。ただし、このシステムの化膿レンサ球菌Cas9（SpCas9）は、NGG PAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）しか認識できず、ゲノム編集の範囲が大幅に制限されます。SpCas9のVQR（D1135V / R1335Q / T1337R）バリアントは、イネのNGAA、NGAG、およびNGATPAMを認識できます。ただし、VQRバリアントがNGACPAMを認識できるかどうかは不明なままです。この研究では、VQRバリアントの3つの低編集効率サイト、NAL1-Q1、NAL1-Q2、およびLPA1-Qが、改良されたCRISPR / VQRシステムを使用したゲノム編集用に選択されました。改良されたCRISPR / VQRシステムはこれらの標的部位を効果的に編集し、遺伝子編集効率はそれぞれ9.75％、43.90％、29.26％でした。改良されたCRISPR / VQRシステムによるNGACPAMの認識を確実にするために、葉の長さのNARROW LEAF 1（NAL1）とワックス生合成のGLOSSY1（GL1）遺伝子の2つのNGAC PAM含有サイト（NAL-CとGL1-C）はこの研究では、米のゲノム編集用に選択され、57のトランスジェニック植物が得られました。PCR増幅および配列決定の結果は、27植物（47.36％）がNAL1-C部位に突然変異を有し、44植物（77.19％）がGL1遺伝子に突然変異を有し、26植物（45.61％）がNAL-Cに突然変異を有することを示した。およびGL1-Cサイト。さらなる分析により、CRISPR / VQRシステムによって引き起こされる突然変異には、ハイブリッド突然変異、二対立遺伝子突然変異、キメラ突然変異、ホモ接合突然変異の4種類がそれぞれあることが明らかになりました。それらの中で、ヘテロ接合性突然変異と二対立遺伝子突然変異が支配的な変化でした。これらの結果は、改良されたCRISPR / VQRシステムが、米のNGAC PAMサイトを効率的に編集し、豊富な変異型を生成できることを示しています。この研究は、イネおよび他の関連植物におけるNGACPAM編集の理論的基礎を提供します。"]
[140,29807545,"plant","rice; wheat","CRISPR;Cas9;","an endogenous gene","Genome biology","Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion.",2018,"19(1):59","[Li C et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",29807545,"10.1186/s13059-018-1443-z ","Nucleotide base editors in plants have been limited to conversion of cytosine to  thymine. Here, we describe a new plant adenine base editor based on an evolved tRNA adenosine deaminase fused to the nickase CRISPR/Cas9, enabling A*T to G*C conversion at frequencies up to 7.5% in protoplasts and 59.1% in regenerated rice and wheat plants. An endogenous gene is also successfully modified through introducing a gain-of-function point mutation to directly produce an herbicide-tolerant rice plant. With this new adenine base editing system, it is now possible to precisely edit all base pairs, thus expanding the toolset for precise editing in plants.","rice; wheat","植物のヌクレオチドベースエディターは、シトシンからチミンへの変換に限定されています。ここでは、ニッカーゼCRISPR / Cas9に融合した進化したtRNAアデノシンデアミナーゼに基づく新しい植物アデニンベースエディターについて説明します。これにより、プロトプラストで最大7.5％、再生米と小麦で最大59.1％の頻度でA * TからG * Cへの変換が可能になります。植物。内因性遺伝子はまた、除草剤耐性イネを直接生産するための機能獲得点突然変異を導入することによって首尾よく改変されています。この新しいアデニン塩基編集システムにより、すべての塩基ペアを正確に編集できるようになり、植物での正確な編集のためのツールセットが拡張されました。"]
[141,29692557,"plant","rose (Rosa hybrida)","Agroinfiltration;","different sets of flower color genes","Physiology and molecular biology of plants","Agroinfiltration: a rapid and reliable method to select suitable rose cultivars for blue flower production.",2018,"24(3):503-511","[Zeinipour M et al.]","Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran.",29692557,"10.1007/s12298-018-0516-5 ","Rose cultivars with blue flower color are among the most attractive breeding targets in floriculture. However, they are difficult to produce due to the low efficiency of transformation systems, interactive effects of hosts and vectors, and lengthy processes. In this study, agroinfiltration-mediated transient expression was investigated as a tool to assess the function of flower color genes and to determine appropriate host cultivars for stable transformation in Rosa hybrida. To induce delphinidin accumulation and consequently to produce blue hue, the petals of 30 rose cultivars were infiltrated with three different expression vectors namely pBIH-35S-CcF3'5'H, pBIH-35S-Del2 and pBIH-35S-Del8, harbouring different sets of flower color genes. The results obtained showed that the ectopic expression of the genes was only detected in three cultivars with dark pink petals (i.e. 'Purple power', 'High & Mora' and 'Marina') after 6-8 days. The high performance liquid chromatography analyses confirmed delphinidin accumulation in the infiltrated petals caused by transient expression of CcF3'5'H gene. Moreover, there were significant differences in the amounts of delphinidin  among the three cultivars infiltrated with the three different expression vectors. More specifically, the highest delphinidin content was detected in the cultivar 'Purple power' (4.67 microg g(-1) FW), infiltrated with the pBIH-35S-Del2 vector. The expression of CcF3'5'H gene in the infiltrated petals was also confirmed by real time PCR. In conclusion and based on the findings of the present study, the agroinfiltration could be regarded as a reliable method to identify suitable rose cultivars in blue rose flower production programs.","rose (Rosa hybrida)","青い花の色をしたバラの品種は、花粉栽培で最も魅力的な繁殖対象の1つです。ただし、変換システムの効率が低く、ホストとベクターの相互作用効果があり、プロセスが長いため、作成が困難です。この研究では、アグロインフィルトレーションを介した一過性発現を、花の色の遺伝子の機能を評価し、Rosahybridaの安定した形質転換に適した宿主栽培品種を決定するためのツールとして調査しました。デルフィニジンの蓄積を誘発し、その結果として青い色合いを生み出すために、30のバラの栽培者の花弁に、異なるセットを含む3つの異なる発現ベクター、すなわちpBIH-35S-CcF3'5'H、pBIH-35S-Del2、およびpBIH-35S-Del8を浸透させました。花の色の遺伝子の。得られた結果は、遺伝子の異所性発現が、6〜8日後に濃いピンクの花びらを持つ3つの栽培品種（すなわち、「パープルパワー」、「ハイ＆モラ」および「マリーナ」）でのみ検出されたことを示した。高速液体クロマトグラフィー分析により、CcF3'5'H遺伝子の一過性発現によって引き起こされた浸潤した花弁におけるデルフィニジンの蓄積が確認されました。さらに、3つの異なる発現ベクターを浸透させた3つの栽培品種間でデルフィニジンの量に有意差がありました。より具体的には、最高のデルフィニジン含有量は、pBIH-35S-Del2ベクターを浸透させた栽培品種「パープルパワー」（4.67 microg g（-1）FW）で検出されました。浸潤した花弁におけるCcF3'5'H遺伝子の発現もリアルタイムPCRによって確認された。結論として、そして本研究の発見に基づいて、アグロインフィルトレーションは、青いバラの花の生産プログラムにおいて適切なバラの栽培者を特定するための信頼できる方法と見なすことができます。"]
[142,29421512,"plant","Salvia miltiorrhiza","CRISPR;Cas9;","rosmarinic acid synthase gene (SmRAS)","Phytochemistry","CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis of RAS in Salvia miltiorrhiza.",2018,"148:63-70","[Zhou Z et al.]","Second Military Medical  University, Shanghai, China.",29421512,"10.1016/j.phytochem.2018.01.015 ","The CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR-associated) system is a powerful genome editing tool that has been used in many species. In this study, we focused on the phenolic acid metabolic pathway in the traditional Chinese medicinal herb Salvia miltiorrhiza, using the CRISPR/Cas9 system to edit the rosmarinic acid synthase gene (SmRAS) in the water-soluble phenolic acid biosynthetic pathway. The single guide RNA (sgRNA) was designed to precisely edit the most important SmRAS gene, which was selected  from 11 family members through a bioinformatics analysis. The sequencing results  showed that the genomes of 50% of the transgenic regenerated hairy roots had been successfully edited. Five biallelic mutants, two heterozygous mutants and one homozygous mutant were obtained from 16 independent transgenic hairy root lines when the sgRNA was driven by the Arabidopsis U6 promoter, while no mutants were obtained from 13 independent transgenic hairy root lines when the sgRNA was driven by the rice U3 promoter. Subsequently, expression and metabolomics analysis showed that the contents of phenolic acids, including rosmarinic acid (RA) and lithospermic acid B, and the RAS expression level were decreased in the  successfully edited hairy root lines, particularly in the homozygous mutants. In  addition, the level of the RA precursor 3,4-dihydroxyphenyllactic acid clearly increased. These results indicated that the CRISPR/Cas9 system can be utilized to identify important genes in a gene family with the assistance of bioinformatics analysis and that this new technology is an efficient and specific tool for genome editing in S. miltiorrhiza. This new system presents a promising potential method to regulate plant metabolic networks and improve the quality of traditional Chinese medicinal herbs.","Salvia miltiorrhiza","CRISPR（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）/ Cas9（CRISPR関連）システムは、多くの種で使用されている強力なゲノム編集ツールです。この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して水溶性フェノール酸生合成経路のロスマリン酸シンターゼ遺伝子（SmRAS）を編集し、伝統的な中国の薬草Salviamiltiorrhizaのフェノール酸代謝経路に焦点を当てました。シングルガイドRNA（sgRNA）は、バイオインフォマティクス分析を通じて11人の家族から選択された最も重要なSmRAS遺伝子を正確に編集するように設計されました。シーケンシングの結果は、トランスジェニック再生毛状根の50％のゲノムが正常に編集されたことを示しました。sgRNAがArabidopsisU6プロモーターによって駆動された場合、5つの二対立遺伝子変異体、2つのヘテロ接合変異体および1つのホモ接合変異体が16の独立したトランスジェニック毛状根株から得られたが、sgRNAが米U3プロモーター。その後、発現および代謝分析により、ロズマリン酸（RA）およびリトスペルミン酸Bを含むフェノール酸の含有量、およびRAS発現レベルが、編集に成功した毛深い根系、特にホモ接合変異体で減少したことが示された。さらに、RA前駆体3,4-ジヒドロキシフェニル乳酸のレベルは明らかに増加しました。これらの結果は、CRISPR / Cas9システムを利用して、バイオインフォマティクス分析の助けを借りて遺伝子ファミリーの重要な遺伝子を特定できること、およびこの新しいテクノロジーがS.miltiorrhizaのゲノム編集のための効率的かつ特定のツールであることを示しています。この新しいシステムは、植物の代謝ネットワークを調節し、伝統的な中国の薬草の品質を改善するための有望な潜在的な方法を提示します。"]
[143,30583622,"plant","Salvia miltiorrhiza","CRISPR;Cas9;","SmPAL1","Zhongguo Zhong yao za zhi = Zhongguo zhongyao zazhi = China journal of Chinese materia medica","[Directing construction of CRISPR/Cas9 vector of SmPAL1 in Salvia miltiorrhiza by target efficiency detection in vitro].",2018,"43(21):4226-4230","[Qiu JR et al.]","Shandong Agricultural University, Taian, China.",30583622,"10.19540/j.cnki.cjcmm.20180726.007 ","To construct CRISPR/Cas9 vectors for the editing of SmPAL1 in the phenylpropane metabolic pathway of Salvia miltiorrhiza, CIRSPR/Cas9 target sites of SmPAL1 were designed by online software. Its target efficiencies were detected in vitro by enzyme digestion and sequences with highly efficiency were constructed into CRISPR/Cas9 vectors. Three possible CRISPR target sequences (SmPAL1-g1, SmPAL1-g2, SmPAL1-g3) were designed and the enzyme digestion efficiencies were 53.3%, 76.6% and 10.0%. SmPAL1-g1 and SmPAL1-g2 were constructed into vector VK005-03 named as VK005-03-g1 and VK005-03-g2. The results of sequencing showed that the two CRISPR/Cas target sequences were all constructed into VK005-03. Here we first laid the foundation for the study of SmPAL1 and provided an effective strategy for the screening of sgRNA.","Salvia miltiorrhiza","Salviamiltiorrhizaのフェニルプロパン代謝経路でSmPAL1を編集するためのCRISPR / Cas9ベクターを構築するために、SmPAL1のCIRSPR / Cas9ターゲットサイトをオンラインソフトウェアで設計しました。その標的効率は酵素消化によってinvitroで検出され、高効率の配列がCRISPR / Cas9ベクターに構築されました。3つの可能なCRISPRターゲット配列（SmPAL1-g1、SmPAL1-g2、SmPAL1-g3）が設計され、酵素消化効率は53.3％、76.6％、10.0％でした。SmPAL1-g1およびSmPAL1-g2は、VK005-03-g1およびVK005-03-g2という名前のベクターV​​K005-03に構築されました。シーケンシングの結果は、2つのCRISPR / CasターゲットシーケンスがすべてVK005-03に構築されたことを示しました。ここでは、最初にSmPAL1の研究の基礎を築き、sgRNAのスクリーニングのための効果的な戦略を提供しました。"]
[144,29621423,"plant","Setaria viridis","CRISPR;Cas9;","GFP","Plant signaling & behavior","Particle bombardment - mediated gene transfer and GFP transient expression in Seteria viridis.",2018,"13(4):e1441657","[Mookkan M et al.]","Bharathidasan University, Tiruchirappalli, Tamil Nadu, India.",29621423,"10.1080/15592324.2018.1441657 ","Setaria viridis is one of the most important model grasses in studying monocot plant biology. Transient gene expression study is a very important tool in plant  biotechnology, functional genomics, and CRISPR-Cas9 genome editing technology via particle bombardment. In this study, a particle bombardment-mediated protocol was developed to introduce DNA into Setaria viridis in vitro leaf explants. In addition, physical and biological parameters, such as helium pressure, distance from stopping screen to the target tissues, DNA concentration, and number of bombardments, were tested and optimized. Optimum concentration of transient GFP expression was achieved using 1.5 ug plasmid DNA with 0.6 mm gold particles and 6 cm bombardment distance, using 1,100 psi. Doubling the bombardment instances provides the maximum number of foci of transient GFP expression. This simple protocol will be helpful for genomics studies in the S. viridis monocot model.","Setaria viridis","エノコログサは、単子葉植物の生物学を研究する上で最も重要なモデル草の1つです。一過性遺伝子発現研究は、植物バイオテクノロジー、機能ゲノミクス、および粒子衝撃によるCRISPR-Cas9ゲノム編集技術において非常に重要なツールです。この研究では、粒子衝撃を介したプロトコルを開発して、DNAをSetariaviridisのinvitro葉外植片に導入しました。さらに、ヘリウム圧力、停止スクリーンから標的組織までの距離、DNA濃度、爆撃の回数などの物理的および生物学的パラメーターがテストされ、最適化されました。一過性GFP発現の最適濃度は、0.6mmの金粒子と6cmの衝撃距離を備えた1.5ugのプラスミドDNAを使用し、1,100psiを使用して達成されました。爆撃インスタンスを2倍にすると、一過性GFP発現の病巣の最大数が得られます。この単純なプロトコルは、S。viridisモノコットモデルでのゲノミクス研究に役立ちます。"]
[145,29327444,"plant","sorghum","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Developing a flexible, high-efficiency Agrobacterium-mediated sorghum transformation system with broad application.",2018,"16(7):1388-1395","[Che P  et al.]","DuPont Pioneer, Johnston, IA, USA.",29327444,"10.1111/pbi.12879 ","Sorghum is the fifth most widely planted cereal crop in the world and is commonly cultivated in arid and semi-arid regions such as Africa. Despite its importance as a food source, sorghum genetic improvement through transgenic approaches has been limited because of an inefficient transformation system. Here, we report a ternary vector (also known as cohabitating vector) system using a recently described pVIR accessory plasmid that facilitates efficient Agrobacterium-mediated transformation of sorghum. We report regeneration frequencies ranging from 6% to 29% in Tx430 using different selectable markers and single copy, backbone free 'quality events' ranging from 45% to 66% of the total events produced. Furthermore, we successfully applied this ternary system to develop transformation protocols for popular but recalcitrant African varieties including Macia, Malisor 84-7 and Tegemeo. In addition, we report the use of this technology to develop the first stable CRISPR/Cas9-mediated gene knockouts in Tx430.","sorghum","ソルガムは世界で5番目に広く植えられている穀物であり、アフリカなどの乾燥および半乾燥地域で一般的に栽培されています。食料源としての重要性にもかかわらず、トランスジェニックアプローチによるソルガムの遺伝的改善は、非効率的な形質転換システムのために制限されてきました。ここでは、ソルガムの効率的なアグロバクテリウムを介した形質転換を促進する最近記載されたpVIRアクセサリープラスミドを使用した三元ベクター（共存ベクターとしても知られている）システムを報告します。さまざまな選択可能なマーカーとシングルコピーを使用して、Tx430で6％から29％の範囲の再生頻度を報告し、生成されたイベント全体の45％から66％の範囲のバックボーンフリーの「品質イベント」を報告します。さらに、この3成分システムを適用して、Macia、Malisor 84-7、Tegemeoなどの人気があるが扱いにくいアフリカの品種の変換プロトコルを開発することに成功しました。さらに、このテクノロジーを使用して、Tx430で最初の安定したCRISPR / Cas9を介した遺伝子ノックアウトを開発したことを報告します。"]
[146,29925584,"plant","sorghum (Sorghum bicolor)","CRISPR;Cas9;","alpha-kafirins (k1C)","Plant physiology","Editing of an Alpha-Kafirin Gene Family Increases, Digestibility and Protein Quality in Sorghum.",2018,"177(4):1425-1438","[Li A  et al.]","University of Nebraska, Lincoln, NE, USA.",29925584,"10.1104/pp.18.00200 ","Kafirins are the major storage proteins in sorghum (Sorghum bicolor) grains and form protein bodies with poor digestibility. Since kafirins are devoid of the essential amino acid lysine, they also impart poor protein quality to the kernel. The alpha-kafirins, which make up most of the total kafirins, are largely encoded by the k1C family of highly similar genes. We used a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) gene editing approach to target the k1C genes to create variants with reduced kafirin levels and improved protein quality and digestibility. A single guide RNA was designed to introduce mutations in a conserved region encoding the endoplasmic reticulum signal peptide of alpha-kafirins. Sequencing of kafirin PCR products revealed extensive edits in 25 of 26 events in one or multiple k1C family members. T1 and T2 seeds showed reduced alpha-kafirin levels, and selected T2 events showed significantly increased grain protein digestibility and lysine content. Thus, a single consensus single guide RNA carrying target sequence mismatches is sufficient for extensive editing of all k1C genes. The resulting quality improvements can be deployed rapidly for breeding and the generation of transgene-free, improved cultivars of sorghum, a major crop worldwide.","sorghum","カフィリンは、ソルガム（Sorghum bicolor）粒子の主要な貯蔵タンパク質であり、消化率の低いタンパク質体を形成します。カフィリンは必須アミノ酸のリジンを欠いているため、カーネルにタンパク質の品質を低下させます。全カフィリンの大部分を構成するアルファカフィリンは、非常に類似した遺伝子のk1Cファミリーによって主にコードされています。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）遺伝子編集アプローチを使用して、k1C遺伝子をターゲットにし、カフィリンレベルを下げ、タンパク質の品質と消化率を改善したバリアントを作成しました。単一のガイドRNAは、アルファカフィリンの小胞体シグナルペプチドをコードする保存領域に変異を導入するように設計されました。カフィリンPCR産物の配列決定により、1つまたは複数のk1Cファミリーメンバーの26のイベントのうち25で広範な編集が明らかになりました。T1およびT2種子は、アルファカフィリンレベルの低下を示し、選択されたT2イベントは、穀物タンパク質の消化率とリジン含有量の大幅な増加を示しました。したがって、すべてのk1C遺伝子を広範囲に編集するには、ターゲット配列の不一致を含む単一のコンセンサス単一ガイドRNAで十分です。結果として得られる品質の改善は、世界中の主要作物であるソルガムの育種とトランスジーンフリーの改善された栽培品種の生成のために迅速に展開することができます。"]
[147,30509166,"plant","soybean","CRISPR;agroinfiltration;","GmMYB118","BMC plant biology","Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress.",2018,"18(1):320","[Du YT et al.]","Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing, China.",30509166,"10.1186/s12870-018-1551-7 ","BACKGROUND: Abiotic stress severely influences plant growth and development. MYB  transcription factors (TFs), which compose one of the largest TF families, play an important role in abiotic stress responses. RESULT: We identified 139 soybean  MYB-related genes; these genes were divided into six groups based on their conserved domain and were distributed among 20 chromosomes (Chrs). Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) indicated that GmMYB118 highly responsive to drought, salt and high temperature stress; thus, this gene was selected for further analysis. Subcellular localization revealed that the GmMYB118 protein located in  the nucleus. Ectopic expression (EX) of GmMYB118 increased tolerance to drought and salt stress and regulated the expression of several stress-associated genes in transgenic Arabidopsis plants. Similarly, GmMYB118-overexpressing (OE) soybean plants generated via Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes)-mediated transformation of the hairy roots showed improved drought and salt tolerance. Furthermore, compared with the control (CK) plants, the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)-transformed plants exhibited reduced drought and salt tolerance. The contents of proline and chlorophyll in the OE plants were significantly greater than those in the CK plants, whose contents were greater than those in the CRISPR plants under drought and salt stress conditions. In contrast, the reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) contents were significantly lower in the OE plants than in  the CK plants, whose contents were lower than those in the CRISPR plants under stress conditions. CONCLUSIONS: These results indicated that GmMYB118 could improve tolerance to drought and salt stress by promoting expression of stress-associated genes and regulating osmotic and oxidizing substances to maintain cell homeostasis.","soybean","背景：非生物的ストレスは、植物の成長と発達に深刻な影響を及ぼします。最大のTFファミリーの1つを構成するMYB転写因子（TF）は、非生物的ストレス応答において重要な役割を果たします。結果：139個の大豆MYB関連遺伝子を同定しました。これらの遺伝子は、保存されたドメインに基づいて6つのグループに分けられ、20の染色体（Chrs）に分布していました。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）は、GmMYB118が干ばつ、塩分、高温ストレスに非常に反応することを示しました。したがって、この遺伝子はさらなる分析のために選択されました。細胞内局在は、GmMYB118タンパク質が核に位置することを明らかにした。GmMYB118の異所性発現（EX）は、干ばつと塩分ストレスに対する耐性を高め、トランスジェニックアラビドプシス植物におけるいくつかのストレス関連遺伝子の発現を調節しました。同様に、Agrobacterium rhizogenes（A。rhizogenes）を介した毛根の形質転換を介して生成されたGmMYB118過剰発現（OE）大豆植物は、改善された干ばつと耐塩性を示しました。さらに、コントロール（CK）植物と比較して、クラスター化された、規則的に間隔を空けた、短いパリンドロームリピート（CRISPR）で形質転換された植物は、干ばつと耐塩性の低下を示しました。OE植物のプロリンとクロロフィルの含有量はCK植物の含有量よりも有意に多く、その含有量は干ばつと塩ストレス条件下でCRISPR植物の含有量よりも多かった。対照的に、活性酸素種（ROS）とマロンジアルデヒド（MDA）の含有量は、ストレス条件下でCRISPRプラントよりも含有量が少ないCKプラントよりもOEプラントで有意に低かった。結論：これらの結果は、GmMYB118がストレス関連遺伝子の発現を促進し、浸透圧および酸化物質を調節して細胞の恒常性を維持することにより、干ばつおよび塩分ストレスに対する耐性を改善できることを示しました。"]
[148,30513774,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;","GmFT2a; GmFT5a","International journal of molecular sciences","CRISPR/Cas9-Mediated Deletion of Large Genomic Fragments in Soybean.",2018,"19(12)","[Cai Y et al.]","Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30513774,"10.3390/ijms19123835 ","At present, the application of CRISPR/Cas9 in soybean (Glycine max (L.) Merr.) has been mainly focused on knocking out target genes, and most site-directed mutagenesis has occurred at single cleavage sites and resulted in short deletions and/or insertions. However, the use of multiple guide RNAs for complex genome editing, especially the deletion of large DNA fragments in soybean, has not been  systematically explored. In this study, we employed CRISPR/Cas9 technology to specifically induce targeted deletions of DNA fragments in GmFT2a (Glyma16g26660) and GmFT5a (Glyma16g04830) in soybean using a dual-sgRNA/Cas9 design. We achieved a deletion frequency of 15.6% for target fragments ranging from 599 to 1618 bp in GmFT2a. We also achieved deletion frequencies of 12.1% for target fragments exceeding 4.5 kb in GmFT2a and 15.8% for target fragments ranging from 1069 to 1161 bp in GmFT5a. In addition, we demonstrated that these CRISPR/Cas9-induced large fragment deletions can be inherited. The T2 'transgene-free' homozygous ft2a mutants with a 1618 bp deletion exhibited the late-flowering phenotype. In this study, we developed an efficient system for deleting large fragments in soybean using CRISPR/Cas9; this system could benefit future research on gene function and improve agriculture via chromosome engineering or customized genetic breeding in soybean.","soybean","現在、大豆（Glycine max（L.）Merr。）でのCRISPR / Cas9の適用は、主に標的遺伝子のノックアウトに焦点が当てられており、ほとんどの部位特異的変異誘発は単一の切断部位で起こり、短い欠失および/または挿入。ただし、複雑なゲノム編集、特に大豆の大きなDNAフラグメントの削除に複数のガイドRNAを使用することは、体系的に検討されていません。この研究では、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、デュアルsgRNA / Cas9設計を使用して、大豆のGmFT2a（Glyma16g26660）およびGmFT5a（Glyma16g04830）のDNAフラグメントのターゲット削除を特異的に誘導しました。GmFT2aで599〜1618 bpの範囲のターゲットフラグメントで15.6％の削除頻度を達成しました。また、GmFT2aで4.5 kbを超えるターゲットフラグメントで12.1％、GmFT5aで1069〜1161 bpの範囲のターゲットフラグメントで15.8％の削除頻度を達成しました。さらに、これらのCRISPR / Cas9によって誘発された大きなフラグメントの削除が継承できることを示しました。1618bpの欠失を持つT2 '導入遺伝子フリー'ホモ接合型ft2a変異体は、開花後期の表現型を示しました。この研究では、CRISPR / Cas9を使用して大豆の大きな断片を削除するための効率的なシステムを開発しました。このシステムは、遺伝子機能に関する将来の研究に役立ち、染色体工学または大豆のカスタマイズされた遺伝子育種を介して農業を改善する可能性があります。"]
[149,28509421,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","GmFT2a","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean.",2018,"16(1):176-185","[Cai Y et al.]","Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",28509421,"10.1111/pbi.12758 ","Flowering is an indication of the transition from vegetative growth to reproductive growth and has considerable effects on the life cycle of soya bean (Glycine max). In this study, we employed the CRISPR/Cas9 system to specifically  induce targeted mutagenesis of GmFT2a, an integrator in the photoperiod flowering pathway in soya bean. The soya bean cultivar Jack was transformed with three sgRNA/Cas9 vectors targeting different sites of endogenous GmFT2a via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Site-directed mutations were observed at all targeted sites by DNA sequencing analysis. T1-generation soya bean plants homozygous for null alleles of GmFT2a frameshift mutated by a 1-bp insertion or short deletion exhibited late flowering under natural conditions (summer) in Beijing, China (N39 degrees 58', E116 degrees 20'). We also found that the targeted mutagenesis was stably heritable in the following T2 generation, and the homozygous GmFT2a mutants exhibited late flowering under both long-day and short-day conditions. We identified some 'transgene-clean' soya bean plants that were homozygous for null alleles of endogenous GmFT2a and without any transgenic element from the T1 and T2 generations. These 'transgene-clean' mutants of GmFT2a may provide materials for more in-depth research of GmFT2a functions and the molecular mechanism of photoperiod responses in soya bean. They will also contribute to soya bean breeding and regional introduction.","soybean","開花は、栄養成長から生殖成長への移行の指標であり、大豆（Glycine max）のライフサイクルにかなりの影響を及ぼします。この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して、大豆の光周期開花経路のインテグレーターであるGmFT2aの標的突然変異誘発を特異的に誘導しました。ダイズ品種ジャックは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換を介して、内因性GmFT2aの異なる部位を標的とする3つのsgRNA / Cas9ベクターで形質転換されました。DNA配列分析により、すべての標的部位で部位特異的変異が観察された。1 bpの挿入または短い削除によって変異したGmFT2aフレームシフトのヌル対立遺伝子についてホモ接合性のT1世代大豆植物は、中国の北京（N39度58 '、E116度20'）で自然条件下（夏）で遅い開花を示しました。また、標的突然変異誘発は次のT2世代で安定して遺伝し、ホモ接合性GmFT2a突然変異体は長日および短日の両方の条件下で開花が遅いことを示しました。内因性GmFT2aのヌル対立遺伝子についてホモ接合性であり、T1およびT2世代からのトランスジェニック要素を含まないいくつかの「トランスジーンクリーン」大豆豆植物を同定した。GmFT2aのこれらの「導入遺伝子クリーン」変異体は、GmFT2a機能および大豆の光周期応答の分子メカニズムのより詳細な研究のための材料を提供する可能性があります。また、大豆の育種や地域の紹介にも貢献します。"]
[150,29333573,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","GmPPD1; GmPPD2","Plant cell reports","Simultaneous site-directed mutagenesis of duplicated loci in soybean using a single guide RNA.",2018,"37(3):553-563","[Kanazashi Y et al.]","Hokkaido University, Sapporo, Hokkaido, Japan.",29333573,"10.1007/s00299-018-2251-3 ","KEY MESSAGE: Using a gRNA and Agrobacterium-mediated transformation, we performed simultaneous site-directed mutagenesis of two GmPPD loci in soybean. Mutations in GmPPD loci were confirmed in at least 33% of T2 seeds. The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease 9 (Cas9) system is a powerful tool for site-directed mutagenesis in crops. Using a  single guide RNA (gRNA) and Agrobacterium-mediated transformation, we performed simultaneous site-directed mutagenesis of two homoeologous loci in soybean (Glycine max), GmPPD1 and GmPPD2, which encode the orthologs of Arabidopsis thaliana PEAPOD (PPD). Most of the T1 plants had heterozygous and/or chimeric mutations for the targeted loci. The sequencing analysis of T1 and T2 generations indicates that putative mutation induced in the T0 plant is transmitted to the T1 generation. The inheritable mutation induced in the T1 plant was also detected. This result indicates that continuous induction of mutations during T1 plant development increases the occurrence of mutations in germ cells, which ensures the transmission of mutations to the next generation. Simultaneous site-directed  mutagenesis in both GmPPD loci was confirmed in at least 33% of T2 seeds examined. Approximately 19% of double mutants did not contain the Cas9/gRNA expression construct. Double mutants with frameshift mutations in both GmPPD1 and GmPPD2 had dome-shaped trifoliate leaves, extremely twisted pods, and produced few seeds. Taken together, our data indicate that continuous induction of mutations in the whole plant and advancing generations of transgenic plants enable efficient simultaneous site-directed mutagenesis in duplicated loci in soybean.","soybean","重要なメッセージ：gRNAとアグロバクテリウムを介した形質転換を使用して、大豆中の2つのGmPPD遺伝子座の部位特異的突然変異誘発を同時に実行しました。GmPPD遺伝子座の変異は、T2種子の少なくとも33％で確認されました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連エンドヌクレアーゼ9（Cas9）システムは、作物の部位特異的突然変異誘発のための強力なツールです。シングルガイドRNA（gRNA）とアグロバクテリウムを介した形質転換を使用して、シロイヌナズナPEAPOD（PPD）のオルソログをコードするダイズ（Glycine max）の2つの同祖遺伝子座GmPPD1とGmPPD2の部位特異的突然変異誘発を同時に行いました。ほとんどのT1植物は、標的遺伝子座に対してヘテロ接合性および/またはキメラ変異を持っていました。T1およびT2世代のシーケンス分析は、T0植物で誘発された推定突然変異がT1世代に伝達されることを示しています。T1植物に誘発された遺伝性変異も検出されました。この結果は、T1植物の発育中に突然変異が継続的に誘導されると、生殖細胞での突然変異の発生が増加し、次世代への突然変異の伝達が確実になることを示しています。両方のGmPPD遺伝子座における同時部位特異的突然変異誘発が、検査されたT2種子の少なくとも33％で確認された。二重変異体の約19％はCas9 / gRNA発現コンストラクトを含んでいませんでした。GmPPD1とGmPPD2の両方にフレームシフト突然変異を持つ二重突然変異体は、ドーム型のカラタチの葉、極端にねじれた鞘を持ち、種子をほとんど生成しませんでした。まとめると、我々のデータは、植物全体における突然変異の継続的な誘導およびトランスジェニック植物の世代の進歩が、大豆の複製された遺伝子座における効率的な同時部位特異的突然変異誘発を可能にすることを示している。"]
[151,29959122,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","sucrose non-fermenting related protein kinase (SmSnRK1.1; GmSnRK1.2)","Yi chuan = Hereditas","[Preliminary analysis of the role of GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2 in the ABA and alkaline stress response of the soybean using the CRISPR/Cas9-based gene double-knockout system].",2018,"40(6):496-507","[Li HQ et al.]","Northeast Agricultural University, Harbin, China.",29959122,"10.16288/j.yczz.17-424 ","Sucrose non-fermenting related protein kinases (SnRKs) are a ubiquitous Ser/Thr protein kinase in the plant kingdom. These kinases play important roles in plant  growth, development, metabolism and resistance to environmental stresses. The soybean (Glycine max L.) genome has four SnRK1 genes, of which GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2 are predominant and participate in multiple stress response pathways. To dissect the mechanism of the role of GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2 proteins in response to ABA and alkaline stresses, we constructed a dual-gRNA CRISPR vector to specifically knock out GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2. The resultant constructs were  transformed into soybean cotyledon nodes to induce hairy roots by agrobacteria (Agrobacterium rhizogenes). The soybean hairy roots obtained were genotyped, and  the results showed that GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2 were efficiently doubly knocked out in 48.6% hairy roots. We also generated control hairy roots that over-expressed GmSnRK1. The materials were treated with 25 mumol/L ABA for 15 days and the results showed that the growths of wild-type and GmSnRK1 over-expressed roots were significantly inhibited than GmSnRK1.1 GmSnRK1.2 double-knockout roots, as the controls displayed less root lengths and fresh weights. However, after treating with 50 mmol/L NaHCO3 for 15 days, we found that the growths of GmSnRK1.1 GmSnRK1.2 double-knockout roots were significantly inhibited than the wild-type and GmSnRK1 over-expressed control roots, as the knockout groups contained less root lengths and fresh weights. These results implied that the GmSnRK1.1 GmSnRK1.2 double knockout mitigated hairy root sensitivity to ABA and resistance to alkaline stress. Taken together, we established the CRISPR/Cas9 system to perform gene double knockout in the soybean and by using this technique, we determined the roles of GmSnRK1.1 and GmSnRK1.2 in response of abiotic stresses.","soybean","ショ糖非発酵関連プロテインキナーゼ（SnRK）は、植物界に遍在するSer / Thrプロテインキナーゼです。これらのキナーゼは、植物の成長、発達、代謝、および環境ストレスへの耐性において重要な役割を果たします。ダイズ（Glycine max L.）ゲノムには4つのSnRK1遺伝子があり、そのうちGmSnRK1.1とGmSnRK1.2が優勢であり、複数のストレス応答経路に関与しています。ABAおよびアルカリストレスに応答したGmSnRK1.1およびGmSnRK1.2タンパク質の役割のメカニズムを分析するために、GmSnRK1.1およびGmSnRK1.2を特異的にノックアウトするデュアルgRNACRISPRベクターを構築しました。得られた構築物をダイズ子葉ノードに形質転換して、アグロバクテリウム（Agrobacterium rhizogenes）によって毛状根を誘導した。得られたダイズ毛状根の遺伝子型を決定した結果、GmSnRK1.1とGmSnRK1.2が48.6％の毛状根で効率的に二重にノックアウトされたことが示された。また、GmSnRK1を過剰発現するコントロールの毛根を生成しました。材料を25mumol / L ABAで15日間処理した結果、野生型およびGmSnRK1の過剰発現根の成長は、GmSnRK1.1GmSnRK1.2ダブルノックアウト根よりも有意に阻害されたことが示されました。根の長さと新鮮な重み。しかし、50 mmol / L NaHCO3で15日間処理した後、GmSnRK1.1 GmSnRK1.2ダブルノックアウト根の成長は、ノックアウトグループとして野生型およびGmSnRK1過剰発現対照根よりも有意に阻害されることがわかりました。より少ない根の長さと新鮮な重みが含まれていました。これらの結果は、GmSnRK1.1GmSnRK1.2ダブルノックアウトがABAに対する毛根の感受性とアルカリ性ストレスに対する耐性を軽減したことを示唆しています。一緒に、我々は大豆で遺伝子ダブルノックアウトを実行するためにCRISPR / Cas9システムを確立し、この技術を使用して、非生物的ストレスに応答するGmSnRK1.1とGmSnRK1.2の役割を決定しました。"]
[152,29087011,"plant","soybean (Glycine max); Medicago truncatula","CRISPR;Cas9;TALENs;","soybean Double-stranded RNA-binding2 (GmDrb2a and GmDrb2b); M. truncatula Hua enhancer1 (MtHen1); soybean Dicer-like3 gene and GmHen1a; combining Gmdcl1a, Gmdcl1b and Gmdcl4b mutants with the Gmdrb2ab double mutant","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9 and TALENs generate heritable mutations for genes involved in small RNA processing of Glycine max and Medicago truncatula.",2018,"16(6):1125-1137","[Curtin SJ  et al.]","University of Minnesota, St. Paul, MN, USA.",29087011,"10.1111/pbi.12857 ","Processing of double-stranded RNA precursors into small RNAs is an essential regulator of gene expression in plant development and stress response. Small RNA  processing requires the combined activity of a functionally diverse group of molecular components. However, in most of the plant species, there are insufficient mutant resources to functionally characterize each encoding gene. Here, mutations in loci encoding protein machinery involved in small RNA processing in soya bean and Medicago truncatula were generated using the CRISPR/Cas9 and TAL-effector nuclease (TALEN) mutagenesis platforms. An efficient CRISPR/Cas9 reagent was used to create a bi-allelic double mutant for the two soya bean paralogous Double-stranded RNA-binding2 (GmDrb2a and GmDrb2b) genes. These mutations, along with a CRISPR/Cas9-generated mutation of the M. truncatula Hua enhancer1 (MtHen1) gene, were determined to be germ-line transmissible. Furthermore, TALENs were used to generate a mutation within the soya bean Dicer-like2 gene. CRISPR/Cas9 mutagenesis of the soya bean Dicer-like3 gene and the GmHen1a gene was observed in the T0 generation, but these mutations failed to transmit to the T1 generation. The irregular transmission of induced mutations and the corresponding transgenes was investigated by whole-genome sequencing to reveal a spectrum of non-germ-line-targeted mutations and multiple transgene insertion events. Finally, a suite of combinatorial mutant plants were generated  by combining the previously reported Gmdcl1a, Gmdcl1b and Gmdcl4b mutants with the Gmdrb2ab double mutant. Altogether, this study demonstrates the synergistic use of different genome engineering platforms to generate a collection of useful  mutant plant lines for future study of small RNA processing in legume crops.","soybean (Glycine max); Medicago truncatula","二本鎖RNA前駆体の低分子RNAへのプロセシングは、植物の発育とストレス応答における遺伝子発現の重要な調節因子です。低分子RNA処理には、機能的に多様な分子成分のグループの複合的な活動が必要です。しかし、ほとんどの植物種では、各コード遺伝子を機能的に特徴づけるのに十分な変異資源がありません。ここでは、大豆豆とMedicago truncatulaのsmall RNA処理に関与するタンパク質機構をコードする遺伝子座の変異が、CRISPR / Cas9およびTALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）変異誘発プラットフォームを使用して生成されました。効率的なCRISPR / Cas9試薬を使用して、2つの大豆パラロガス二本鎖RNA結合2（GmDrb2aおよびGmDrb2b）遺伝子のバイアレリック二重変異体を作成しました。これらの変異は、CRISPR / Cas9によって生成されたM.truncatula Huaエンハンサー1（MtHen1）遺伝子の変異とともに、生殖細胞系に伝染することが確認されました。さらに、TALENを使用して、大豆のDicer-like2遺伝子内に変異を生成しました。大豆ダイサー様3遺伝子とGmHen1a遺伝子のCRISPR / Cas9変異誘発がT0世代で観察されたが、これらの変異はT1世代に伝達されなかった。誘発された突然変異および対応する導入遺伝子の不規則な伝達は、全ゲノム配列決定によって調査され、生殖細胞系列を標的としない突然変異および複数の導入遺伝子挿入イベントのスペクトルが明らかになった。最後に、以前に報告されたGmdcl1a、Gmdcl1b、およびGmdcl4b変異体をGmdrb2ab二重変異体と組み合わせることにより、一連のコンビナトリアル変異体植物が生成されました。まとめると、この研究は、さまざまなゲノムエンジニアリングプラットフォームを相乗的に使用して、マメ科作物におけるsmallRNAプロセッシングの将来の研究に役立つ変異植物系統のコレクションを生成することを示しています。"]
[153,29577545,"plant","wild strawberry (Fragaria vesca)","CRISPR;Cas9;","auxin biosynthesis gene TAA1 and auxin response factor 8 (ARF8)","Plant biotechnology journal","Efficient genome editing of wild strawberry genes, vector development and validation.",2018,"16(11):1868-1877","[Zhou J et al.]","University of Maryland, College Park, MD, USA.",29577545,"10.1111/pbi.12922 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 system is an effective genome editing tool for plant and animal genomes. However, there are still few reports on the successful application of CRISPR-Cas9 to horticultural plants, especially with regard to germ-line transmission of targeted mutations. Here, we report high-efficiency genome editing in the wild strawberry Fragaria vesca and its successful application to mutate the auxin biosynthesis gene TAA1 and auxin response factor 8 (ARF8). In our CRISPR system,  the Arabidopsis U6 promoter AtU6-26 and the wild strawberry U6 promoter FveU6-2 were each used to drive the expression of sgRNA, and both promoters were shown to lead to high-efficiency genome editing in strawberry. To test germ-line transmission of the edited mutations and new mutations induced in the next generation, the progeny of the primary (T0) transgenic plants carrying the CRISPR construct was analysed. New mutations were detected in the progeny plants at a high efficiency, including large deletions between the two PAM sites. Further, T1 plants harbouring arf8 homozygous knockout mutations grew considerably faster than wild-type plants. The results indicate that our CRISPR vectors can be used to edit the wild strawberry genome at a high efficiency and that both sgRNA design and appropriate U6 promoters contribute to the success of genomic editing. Our results open up exciting opportunities for engineering strawberry and related horticultural crops to improve traits of economic importance.","strawberry","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-Cas9システムは、植物および動物のゲノムのための効果的なゲノム編集ツールです。ただし、特に標的変異の生殖細胞系伝達に関して、CRISPR-Cas9の園芸植物への適用の成功に関する報告はまだほとんどありません。ここでは、野生のイチゴFragaria vescaでの高効率のゲノム編集と、オーキシン生合成遺伝子TAA1およびオーキシン応答因子8（ARF8）を変異させるためのその成功したアプリケーションについて報告します。私たちのCRISPRシステムでは、Arabidopsis U6プロモーターAtU6-26と野生のイチゴU6プロモーターFveU6-2がそれぞれsgRNAの発現を駆動するために使用され、両方のプロモーターがイチゴの高効率ゲノム編集につながることが示されました。編集された突然変異および次世代で誘発された新しい突然変異の生殖系列伝達を試験するために、CRISPR構築物を運ぶ一次（T0）トランスジェニック植物の子孫を分析した。2つのPAM部位間の大きな欠失を含む、新しい突然変異が子孫植物で高効率で検出されました。さらに、arf8ホモ接合ノックアウト変異を有するT1植物は、野生型植物よりもかなり速く成長しました。結果は、当社のCRISPRベクターを使用して野生のイチゴゲノムを高効率で編集できること、およびsgRNA設計と適切なU6プロモーターの両方がゲノム編集の成功に貢献していることを示しています。私たちの結果は、経済的に重要な形質を改善するためにイチゴと関連する園芸作物を設計するための刺激的な機会を開きます。"]
[154,28905511,"plant","sugarcane","TALENs;","caffeic acid O-methyltransferase (COMT)","Plant biotechnology journal","TALEN-mediated targeted mutagenesis of more than 100 COMT copies/alleles in highly polyploid sugarcane improves saccharification efficiency without compromising biomass yield.",2018,"16(4):856-866","[Kannan B et al.]","University of Florida, Gainesville, FL, USA.",28905511,"10.1111/pbi.12833 ","Sugarcane is the world's most efficient feedstock for commercial production of bioethanol due to its superior biomass production and accumulation of sucrose in  stems. Integrating first- and second-generation ethanol conversion processes will enhance the biofuel yield per unit area by utilizing both sucrose and cell wall-bound sugars for fermentation. RNAi suppression of the lignin biosynthetic gene caffeic acid O-methyltransferase (COMT) has been demonstrated to improve bioethanol production from lignocellulosic biomass. Genome editing has been used  in a number of crops for creation of loss of function phenotypes but is very challenging in sugarcane due to its highly polyploid genome. In this study, a conserved region of COMT was targeted with a single-transcription activator-like  effector nuclease (TALEN) pair for multi-allelic mutagenesis to modify lignin biosynthesis in sugarcane. Field-grown TALEN-mediated COMT mutants showed up to 19.7% lignin reduction and significantly decreased syringyl to guaiacyl (S/G) ratio resulting in an up to 43.8% improved saccharification efficiency. Biomass production of COMT mutant lines with superior saccharification efficiency did not differ significantly from the original cultivar under replicated field conditions. Sanger sequencing of cloned COMT amplicons (1351-1657 bp) revealed co-editing of 107 of the 109 unique COMT copies/alleles in vegetative progeny of  line CB6 using a single TALEN pair. Line CB6 combined altered cell wall composition and drastically improved saccharification efficiency with good agronomic performance. These findings confirm the feasibility of co-mutagenesis of a very large number of target alleles/copies for improvement in crops with complex genomes.","sugarcane","サトウキビは、その優れたバイオマス生産と茎へのスクロースの蓄積により、バイオエタノールの商業生産のための世界で最も効率的な原料です。第1世代と第2世代のエタノール変換プロセスを統合すると、発酵にスクロースと細胞壁結合糖の両方を利用することにより、単位面積あたりのバイオ燃料収量が向上します。リグニン生合成遺伝子カフェイン酸O-メチルトランスフェラーゼ（COMT）のRNAi抑制は、リグノセルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産を改善することが実証されています。ゲノム編集は、機能喪失表現型を作成するために多くの作物で使用されてきましたが、その高度に倍数体のゲノムのため、サトウキビでは非常に困難です。この研究では、COMTの保存領域を、サトウキビのリグニン生合成を改変するための多対立遺伝子突然変異誘発のための単一転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）ペアで標的化した。野外で栽培されたTALENを介したCOMT変異体は、最大19.7％のリグニン減少を示し、シリンギルとグアヤシル（S / G）の比率が大幅に低下し、最大43.8％の糖化効率が向上しました。優れた糖化効率を有するCOMT変異株のバイオマス生産は、複製された野外条件下で元の栽培品種と有意に異ならなかった。クローン化されたCOMTアンプリコン（1351-1657 bp）のサンガーシーケンシングにより、単一のTALENペアを使用して、ラインCB6の栄養子孫における109個の固有のCOMTコピー/対立遺伝子のうち107個の共同編集が明らかになりました。ラインCB6は、変化した細胞壁組成と劇的に改善された糖化効率を優れた農業性能と組み合わせました。これらの発見は、複雑なゲノムを持つ作物の改善のための非常に多数の標的対立遺伝子/コピーの共突然変異誘発の実現可能性を確認します。"]
[155,28640964,"plant","switchgrass (Panicum virgatum L.)","CRISPR;Cas9;","teosinte branched 1a and 1b; phosphoglycerate mutase","Plant biotechnology journal","Targeted mutagenesis in tetraploid switchgrass (Panicum virgatum L.) using CRISPR/Cas9.",2018,"16(2):381-393","[Liu Y et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",28640964,"10.1111/pbi.12778 ","The CRISPR/Cas9 system has become a powerful tool for targeted mutagenesis. Switchgrass (Panicum virgatum L.) is a high yielding perennial grass species that has been designated as a model biomass crop by the U.S. Department of Energy. The self-infertility and high ploidy level make it difficult to study gene function or improve germplasm. To overcome these constraints, we explored the feasibility  of using CRISPR/Cas9 for targeted mutagenesis in a tetraploid cultivar 'Alamo' switchgrass. We first developed a transient assay by which a non-functional green-fluorescent protein gene containing a 1-bp frameshift insertion in its 5' coding region was successfully mutated by a Cas9/sgRNA complex resulting in its restored function. Agrobacterium-mediated stable transformation of embryogenic calli derived from mature caryopses averaged a 3.0% transformation efficiency targeting the genes of teosinte branched 1(tb1)a and b and phosphoglycerate mutase (PGM). With a single construct containing two sgRNAs targeting different regions of tb1a and tb1b genes, primary transformants (T0) containing CRISPR/Cas9-induced mutations were obtained at frequencies of 95.5% (tb1a) and 11% (tb1b), respectively, with T0 mutants exhibiting increased tiller production. Meanwhile, a mutation frequency of 13.7% was obtained for the PGM gene with a CRISPR/Cas9 construct containing a single sgRNA. Among the PGM T0 mutants, six are heterozygous and one is homozygous for a 1-bp deletion in the target region with no apparent phenotypical alterations. We show that CRISPR/Cas9 system can generate targeted mutagenesis effectively and obtain targeted homozygous mutants  in T0 generation in switchgrass, circumventing the need of inbreeding.","switchgrass (Panicum virgatum L.)","CRISPR / Cas9システムは、標的突然変異誘発のための強力なツールになりました。Switchgrass（Panicum virgatum L.）は、米国エネルギー省によってモデルバイオマス作物として指定されている高収量の多年生草種です。自己不活性と高い倍数性レベルは、遺伝子機能の研究や生殖質の改善を困難にします。これらの制約を克服するために、4倍体の栽培品種「アラモ」スイッチグラスでの標的突然変異誘発にCRISPR / Cas9を使用することの実現可能性を調査しました。最初に、5 'コード領域に1bpのフレームシフト挿入を含む非機能的な緑色蛍光タンパク質遺伝子をCas9 / sgRNA複合体によって正常に変異させ、機能を回復させる一過性アッセイを開発しました。成熟したカリオプスに由来する胚形成カルスのアグロバクテリウム媒介安定形質転換は、テオシンテ分岐1（tb1）aおよびbおよびホスホグリセリン酸ムターゼ（PGM）の遺伝子を標的とする平均3.0％の形質転換効率であった。tb1aおよびtb1b遺伝子の異なる領域を標的とする2つのsgRNAを含む単一の構築物では、CRISPR / Cas9誘導変異を含む一次形質転換体（T0）が、T0変異体でそれぞれ95.5％（tb1a）および11％（tb1b）の頻度で得られました。ティラー生産の増加を示しています。一方、単一のsgRNAを含むCRISPR / Cas9コンストラクトを使用したPGM遺伝子では、13.7％の変異頻度が得られました。PGM T0変異体のうち、6つはヘテロ接合であり、1つはホモ接合であり、標的領域の1 bpの欠失について、明らかな表現型の変化はありません。CRISPR / Cas9システムがターゲット突然変異誘発を効果的に生成し、スイッチグラスのT0生成でターゲットホモ接合変異体を取得し、近親交配の必要性を回避できることを示します。"]
[156,29552023,"plant","Theobroma cacao","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","Non-Expressor of Pathogenesis-Related 3 (TcNPR3)","Frontiers in plant science","Transient Expression of CRISPR/Cas9 Machinery Targeting TcNPR3 Enhances Defense Response in Theobroma cacao.",2018,"9:268","[Fister AS et al.]","Pennsylvania State University, University Park, PA,  USA.",29552023,"10.3389/fpls.2018.00268 ","Theobroma cacao, the source of cocoa, suffers significant losses to a variety of  pathogens resulting in reduced incomes for millions of farmers in developing countries. Development of disease resistant cacao varieties is an essential strategy to combat this threat, but is limited by sources of genetic resistance and the slow generation time of this tropical tree crop. In this study, we present the first application of genome editing technology in cacao, using Agrobacterium-mediated transient transformation to introduce CRISPR/Cas9 components into cacao leaves and cotyledon cells. As a first proof of concept, we targeted the cacao Non-Expressor of Pathogenesis-Related 3 (TcNPR3) gene, a suppressor of the defense response. After demonstrating activity of designed single-guide RNAs (sgRNA) in vitro, we used Agrobacterium to introduce a CRISPR/Cas9 system into leaf tissue, and identified the presence of deletions in  27% of TcNPR3 copies in the treated tissues. The edited tissue exhibited an increased resistance to infection with the cacao pathogen Phytophthora tropicalis and elevated expression of downstream defense genes. Analysis of off-target mutagenesis in sequences similar to sgRNA target sites using high-throughput sequencing did not reveal mutations above background sequencing error rates. These results confirm the function of NPR3 as a repressor of the cacao immune system and demonstrate the application of CRISPR/Cas9 as a powerful functional genomics tool for cacao. Several stably transformed and genome edited somatic embryos were obtained via Agrobacterium-mediated transformation, and ongoing work will test the effectiveness of this approach at a whole plant level.","Theobroma cacao","ココアの供給源であるテオブロマカカオは、さまざまな病原体に多大な損失を被り、開発途上国の何百万もの農民の収入を減少させています。耐病性のカカオ品種の開発は、この脅威と戦うための不可欠な戦略ですが、遺伝的耐性の原因とこの熱帯樹木作物の遅い生成時間によって制限されます。この研究では、アグロバクテリウムを介した一過性形質転換を使用してCRISPR / Cas9コンポーネントをカカオの葉と子葉細胞に導入する、カカオにおけるゲノム編集技術の最初のアプリケーションを紹介します。概念の最初の証拠として、防御反応の抑制因子であるカカオの病因関連3の非発現因子（TcNPR3）遺伝子を標的としました。設計されたシングルガイドRNA（sgRNA）のin vitroでの活性を示した後、アグロバクテリウムを使用してCRISPR / Cas9システムを葉組織に導入し、処理組織のTcNPR3コピーの27％に欠失の存在を確認しました。編集された組織は、カカオ病原体Phytophthoratropicalisの感染に対する耐性の増加と下流の防御遺伝子の発現の上昇を示しました。ハイスループットシーケンスを使用したsgRNAターゲットサイトと同様のシーケンスでのオフターゲット突然変異誘発の分析では、バックグラウンドシーケンスエラー率を超える突然変異は明らかになりませんでした。これらの結果は、カカオ免疫系の抑制因子としてのNPR3の機能を確認し、カカオの強力な機能的ゲノミクスツールとしてのCRISPR / Cas9の適用を示しています。いくつかの安定して形質転換され、ゲノム編集された体細胞胚は、アグロバクテリウムを介した形質転換によって得られました。進行中の研究により、植物全体のレベルでこのアプローチの有効性がテストされます。"]
[157,30498659,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","Arabidopsis thaliana genes encoding homogentisate phytyltransferase (HPT) and tocopherol cyclase (TC)","3 Biotech","Rapid enhancement of alpha-tocopherol content in Nicotiana benthamiana by transient expression of Arabidopsis thaliana Tocopherol cyclase and Homogentisate phytyl transferase genes.",2018,"8(12):485","[Sathish S et al.]","Bharathiar University, Coimbatore, India.",30498659,"10.1007/s13205-018-1496-4 ","Agrobacterium-mediated transient gene expression have become a method of choice over stable plant genetic transformation. Tocopherols are a family of vitamin E compounds, which are categorized along with tocotrienols occurring naturally in vegetable oils, nuts and leafy green vegetables. This is the first report involving AtTC and AtHPT transient expression in Nicotiana benthamiana and this system can be used efficiently for large scale production of vitamin E. Agroinfiltration studies were carried out in N.benthamiana for the expression of  Arabidopsis thaliana (At) genes encoding homogentisate phytyltransferase (HPT) and tocopherol cyclase (TC) individually and in combination (HPT + TC). The transgene presence was analyzed by reverse transcription PCR, which showed the presence of both the vitamin E biosynthetic pathway genes. The gene expression analysis was carried out by (reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction) RT-qPCR and alpha-tocopherol content was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC). The relative gene expression analysis by RT-qPCR confirmed an increased expression pattern where TC + HPT combination recorded the highest of 231 fold, followed by TC gene with 186 fold,  whereas the HPT gene recorded 178 fold. The alpha-tocopherol content in leaves expressing HPT, TC, and HPT + TC was increased by 4.2, 5.9 and 11.3 fold, respectively, as compared to the control. These results indicate that the transient expression of HPT and TC genes has enhanced the vitamin E levels and stable expression of both A. thaliana genes could be an efficient strategy to enhance vitamin E biosynthesis in agricultural crop breeding.","tobacco","アグロバクテリウムを介した一過性の遺伝子発現は、安定した植物の遺伝子形質転換よりも選択される方法になっています。トコフェロールはビタミンE化合物のファミリーであり、植物油、ナッツ、緑豊かな緑の野菜に自然に存在するトコトリエノールと一緒に分類されます。これは、ニコチアナベンサミアナタバコにおけるAtTCおよびAtHPTの一過性発現に関する最初の報告であり、このシステムは、ビタミンEの大規模生産に効率的に使用できます。ホモゲンチセートをコードするシロイヌナズナ（At）遺伝子の発現について、N.benthamianaで農業浸潤研究を実施しました。フィチルトランスフェラーゼ（HPT）とトコフェロールシクラーゼ（TC）を個別に、または組み合わせて（HPT + TC）。導入遺伝子の存在は、両方のビタミンE生合成経路遺伝子の存在を示した逆転写PCRによって分析されました。遺伝子発現分析は（逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）RT-qPCRによって実施され、アルファ-トコフェロール含有量は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して定量化されました。RT-qPCRによる相対的な遺伝子発現分析により、TC + HPTの組み合わせが最高の231倍を記録し、次にTC遺伝子が186倍を記録したのに対し、HPT遺伝子は178倍を記録した発現パターンの増加が確認されました。HPT、TC、およびHPT + TCを発現する葉のα-トコフェロール含有量は、対照と比較して、それぞれ4.2、5.9、および11.3倍増加しました。これらの結果は、HPTおよびTC遺伝子の一過性発現がビタミンEレベルを高め、両方のA. thaliana遺伝子の安定した発現が、農作物育種におけるビタミンE生合成を高めるための効率的な戦略である可能性があることを示しています。"]
[158,29301551,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;"," ","Genome biology","RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants.",2018,"19(1):1","[Aman R et al.]","King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia.",29301551,"10.1186/s13059-017-1381-1 ","BACKGROUND: CRISPR/Cas systems confer immunity against invading nucleic acids and phages in bacteria and archaea. CRISPR/Cas13a (known previously as C2c2) is a class 2 type VI-A ribonuclease capable of targeting and cleaving single-stranded  RNA (ssRNA) molecules of the phage genome. Here, we employ CRISPR/Cas13a to engineer interference with an RNA virus, Turnip Mosaic Virus (TuMV), in plants. RESULTS: CRISPR/Cas13a produces interference against green fluorescent protein (GFP)-expressing TuMV in transient assays and stable overexpression lines of Nicotiana benthamiana. CRISPR RNA (crRNAs) targeting the HC-Pro and GFP sequences exhibit better interference than those targeting other regions such as coat protein (CP) sequence. Cas13a can also process pre-crRNAs into functional crRNAs. CONCLUSIONS: Our data indicate that CRISPR/Cas13a can be used for engineering interference against RNA viruses, providing a potential novel mechanism for RNA-guided immunity against RNA viruses and for other RNA manipulations in plants.","tobacco","背景：CRISPR / Casシステムは、細菌や古細菌に侵入する核酸やファージに対する免疫を付与します。CRISPR / Cas13a（以前はC2c2として知られていました）は、ファージゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）分子を標的にして切断することができるクラス2タイプVI-Aリボヌクレアーゼです。ここでは、CRISPR / Cas13aを使用して、植物内のRNAウイルスであるTurnip Mosaic Virus（TuMV）との干渉を設計します。結果：CRISPR / Cas13aは、ニコチアナベンサミアナタバコの一過性アッセイおよび安定した過剰発現ラインで緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するTuMVに対する干渉を引き起こします。HC-ProおよびGFP配列を標的とするCRISPRRNA（crRNA）は、コートタンパク質（CP）配列などの他の領域を標的とするものよりも優れた干渉を示します。Cas13aは、pre-crRNAを機能的なcrRNAに処理することもできます。結論：私たちのデータは、CRISPR / Cas13aがRNAウイルスに対する干渉を操作するために使用できることを示しており、RNAウイルスに対するRNA誘導免疫および植物における他のRNA操作のための潜在的な新しいメカニズムを提供します。"]
[159,29562594,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","Fc-fused capillary morphogenesis protein 2 (CMG2-Fc) containing one N-glycosylation site on the Fc domain","International journal of molecular sciences","Glycoform Modification of Secreted Recombinant Glycoproteins through Kifunensine  Addition during Transient Vacuum Agroinfiltration.",2018,"19(3)","[Xiong Y  et al.]","University of California, Davis, CA, USA.",29562594,"10.3390/ijms19030890 ","Kifunensine, a potent and selective inhibitor of class I alpha-mannosidases, prevents alpha-mannosidases I from trimming mannose residues on glycoproteins, thus resulting in oligomannose-type glycans. We report for the first time that through one-time vacuum infiltration of kifunensine in plant tissue, N-linked glycosylation of a recombinant protein transiently produced in whole-plants shifted completely from complex-type to oligomannose-type. Fc-fused capillary morphogenesis protein 2 (CMG2-Fc) containing one N-glycosylation site on the Fc domain, produced in Nicotiana benthamiana whole plants, served as a model protein. The CMG2-Fc fusion protein was produced transiently through vacuum agroinfiltration, with and without kifunensine at a concentration of 5.4 microM in the agroinfiltration suspension. The CMG2-Fc N-glycan profile was determined using LC-MS/MS with a targeted dynamic multiple reaction monitoring (MRM) method. The CMG2-Fc expression level in the infiltrated plant tissue and the percentage of oligomannose-type N-glycans for kifunensine treated plants was 874 mg/kg leaf  fresh weight (FW) and 98.2%, respectively, compared to 717 mg/kg leaf FW and 2.3% for untreated plants. Oligomannose glycans are amenable to in vitro enzymatic modification to produce more human-like N-glycan structures that are preferred for the production of HIV-1 viral vaccine and certain monoclonal antibodies. This method allows glycan modifications using a bioprocessing approach without compromising protein yield or modification of the primary sequence, and could be  expanded to other small molecule inhibitors of glycan-processing enzymes. For recombinant protein targeted for secretion, kifunensine treatment allows collection of glycoform-modified target protein from apoplast wash fluid (AWF) with minimal plant-specific complex N-glycan at higher starting purity and concentration than in whole-leaf extract, thus simplifying the downstream processing.","tobacco","クラスIα-マンノシダーゼの強力で選択的な阻害剤であるキフネンシンは、α-マンノシダーゼIが糖タンパク質のマンノース残基をトリミングするのを防ぎ、オリゴマンノース型グリカンを生成します。植物組織へのキフネンシンの1回の真空浸透により、植物全体で一過性に産生された組換えタンパク質のN結合型グリコシル化が複合型からオリゴマンノース型に完全に移行したことを初めて報告します。ニコチアナベンサミアナ全植物で産生された、Fcドメイン上に1つのN-グリコシル化部位を含むFc融合毛細血管形態形成タンパク質2（CMG2-Fc）は、モデルタンパク質として機能しました。CMG2-Fc融合タンパク質は、アグロインフィルトレーション懸濁液中の5.4 microMの濃度のキフネンシンの有無にかかわらず、真空アグロインフィルトレーションによって一時的に生成されました。CMG2-Fc N-グリカンプロファイルは、LC-MS / MSとターゲット動的多重反応モニタリング（MRM）法を使用して決定されました。浸潤した植物組織におけるCMG2-Fcの発現レベルとキフネンシン処理植物のオリゴマンノース型N-グリカンの割合は、717 mg / kgの葉のFWと比較して、それぞれ874 mg / kgの葉の新鮮重量（FW）と98.2％でした。未処理の植物では2.3％。オリゴマンノースグリカンは、HIV-1ウイルスワクチンおよび特定のモノクローナル抗体の産生に好ましい、よりヒトに似たN-グリカン構造を産生するためのinvitro酵素修飾に適しています。この方法は、タンパク質収量や一次配列の修飾を損なうことなく、バイオプロセシングアプローチを使用したグリカン修飾を可能にし、グリカンプロセシング酵素の他の小分子阻害剤に拡張することができます。分泌の標的となる組換えタンパク質の場合、キフネンシン処理により、アポプラスト洗浄液（AWF）から、全葉抽出物よりも高い開始純度と濃度で最小の植物特異的複合N型糖鎖を含むグリコフォーム修飾標的タンパク質を収集できるため、下流が簡素化されます。処理。"]
[160,29410083,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","recombinant gp51","Journal of virological methods","Transient expression of a bovine leukemia virus envelope glycoprotein in plants by a recombinant TBSV vector.",2018,"255:1-7","[Zhumabek AT et al.]","National Center for Biotechnology (NCB), 1Astana,  Kazakhstan.",29410083,"10.1016/j.jviromet.2018.01.016 ","Plants offer a unique combination of advantages for the production of valuable recombinant proteins in a relatively short time. For instance, a variety of diagnostic tests have been developed that use recombinant antigens expressed in plants. The envelope glycoprotein gp51 encoded by Bovine leukemia virus (BLV) is  one of the essential subunits for viral infectivity. It was indicated that the recombinant gp51 (rgp51) of BLV small es, Cyrillican be used as an synthetic alternative antigen useful in the diagnosis of BLV infection in cattle. Here we evaluate the potential for using a viral vector based on the genome of Tomato bushy stunt virus (TBSV) for the efficient expression of BLV envelope glycoprotein rgp51 in Nicotiana benthamiana plants. The codon-optimized gene encoding rgp51 was synthesized by the de novo DNA synthesis to replace the GFP gene in the TBSV-derived viral vector that was then delivered into 4-5 week old N. benthamiana plants by agroinfiltration. Expression of recombinant his-tagged rgp51 was verified by protein extraction followed by western blot procedures, and by purification using Ni(2+)-affinity chromatography. The molecular weight of this plant-expressed rgp51 ranged from 43 to 55kDa and it was shown to be glycosylated. Important for potential use in diagnostic tests, purified rgp51 specifically reacted with BLV infected bovine sera while no reaction was observed with the negative serum samples.","tobacco","植物は、比較的短時間で貴重な組換えタンパク質を生産するための独自の利点の組み合わせを提供します。たとえば、植物で発現する組換え抗原を使用するさまざまな診断テストが開発されています。ウシ白血病​​ウイルス（BLV）によってコードされるエンベロープ糖タンパク質gp51は、ウイルス感染性に不可欠なサブユニットの1つです。BLV small esの組換えgp51（rgp51）であるCyrillicanは、牛のBLV感染の診断に有用な合成代替抗原として使用できることが示された。ここでは、ニコチアナベンタミアナ植物におけるBLVエンベロープ糖タンパク質rgp51の効率的な発現のために、トマトブッシースタントウイルス（TBSV）のゲノムに基づくウイルスベクターを使用する可能性を評価します。rgp51をコードするコドン最適化遺伝子は、de novo DNA合成によって合成され、TBSV由来のウイルスベクターのGFP遺伝子を置き換え、その後、アグロインフィルトレーションによって4〜5週齢のN.ベンタミアナ植物に送達されました。組換えhisタグ付きrgp51の発現は、タンパク質抽出とそれに続くウエスタンブロット手順、およびNi（2+）親和性クロマトグラフィーを使用した精製によって検証されました。この植物で発現されたrgp51の分子量は43から55kDaの範囲であり、グリコシル化されていることが示された。診断テストでの潜在的な使用にとって重要な、精製されたrgp51は、BLVに感染したウシの血清と特異的に反応しましたが、陰性の血清サンプルでは反応は観察されませんでした。"]
[161,30022473,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;","chloride channel (CLC-Nt1)","New phytologist","CLC-Nt1 affects Potato Virus Y infection via regulation of endoplasmic reticulum  luminal Ph.",2018,"220(2):539-552","[Sun H et al.]","Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao, China.",30022473,"10.1111/nph.15310 ","Chloride channel (CLC) proteins are important anion transporters conserved in organisms ranging from bacteria and yeast to plants and animals. According to sequence comparison, some plant CLCs are predicted to function as Cl(-) /H(+) antiporters, but not Cl(-) channels. However, no direct evidence was provided to  verify the role of these plant CLCs in regulating the pH of the intracellular compartment. We identified tobacco CLC-Nt1 interacting with the Potato virus Y (PVY) 6K2 protein. To investigate its physiological function, homologous genes of CLC-Nt1 in Nicotiana benthamiana were knocked out using the CRISPR/Cas9 system. Complementation experiments were subsequently performed by expression of wild-type or point-mutated CLC-Nt1 in knockout mutants. The data presented herein demonstrate that CLC-Nt1 is localized at endoplasmic reticulum (ER). Using a pH-sensitive fluorescent protein (pHluorin), we found that loss of CLC-Nt1 function resulted in a decreased ER luminal pH. Secreted GFP (secGFP) was retained mostly in ER in knockout mutants, indicating that CLC-Nt1 is also involved in protein secretion. PVY infection induced a rise in ER luminal pH, which was dependent on functional CLC-Nt1. By contrast, loss of CLC-Nt1 function  inhibited PVY intracellular replication and systemic infection. We propose that PVY alters ER luminal pH for infection in a CLC-Nt1-dependent manner.","tobacco","塩化物チャネル（CLC）タンパク質は、細菌や酵母から植物や動物に至るまでの生物に保存されている重要な陰イオン輸送体です。シーケンス比較によると、一部の植物CLCは、Cl（-）/ H（+）アンチポーターとして機能すると予測されていますが、Cl（-）チャネルとしては機能しないと予測されています。ただし、細胞内コンパートメントのpHの調節におけるこれらの植物CLCの役割を検証するための直接的な証拠は提供されていません。ポテトウイルスY（PVY）6K2タンパク質と相互作用するタバコCLC-Nt1を特定しました。その生理学的機能を調査するために、ニコチアナ・ベンタミアナのCLC-Nt1の相同遺伝子をCRISPR / Cas9システムを使用してノックアウトしました。続いて、ノックアウト変異体における野生型または点変異CLC-Nt1の発現によって補完実験を行った。ここに提示されたデータは、CLC-Nt1が小胞体（ER）に局在していることを示しています。pH感受性蛍光タンパク質（pHluorin）を使用して、CLC-Nt1機能の喪失がER内腔pHの低下をもたらすことを発見しました。分泌されたGFP（secGFP）は、ノックアウト変異体のERにほとんど保持されており、CLC-Nt1もタンパク質分泌に関与していることを示しています。PVY感染は、機能的なCLC-Nt1に依存するER管腔pHの上昇を誘発しました。対照的に、CLC-Nt1機能の喪失は、PVYの細胞内複製と全身感染を抑制しました。PVYがCLC-Nt1依存的に感染のER管腔pHを変化させることを提案します。"]
[162,29451720,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","split-GFP","Plant journal","Detection of membrane protein-protein interaction in planta based on dual-intein-coupled tripartite split-GFP association.",2018,"94(3):426-438","[Liu TY  et al.]","National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.",29451720,"10.1111/tpj.13874 ","Despite the great interest in identifying protein-protein interactions (PPIs) in  biological systems, only a few attempts have been made at large-scale PPI screening in planta. Unlike biochemical assays, bimolecular fluorescence complementation allows visualization of transient and weak PPIs in vivo at subcellular resolution. However, when the non-fluorescent fragments are highly expressed, spontaneous and irreversible self-assembly of the split halves can easily generate false positives. The recently developed tripartite split-GFP system was shown to be a reliable PPI reporter in mammalian and yeast cells. In this study, we adapted this methodology, in combination with the beta-estradiol-inducible expression cassette, for the detection of membrane PPIs  in planta. Using a transient expression assay by agroinfiltration of Nicotiana benthamiana leaves, we demonstrate the utility of the tripartite split-GFP association in plant cells and affirm that the tripartite split-GFP system yields no spurious background signal even with abundant fusion proteins readily accessible to the compartments of interaction. By validating a few of the Arabidopsis PPIs, including the membrane PPIs implicated in phosphate homeostasis, we proved the fidelity of this assay for detection of PPIs in various cellular compartments in planta. Moreover, the technique combining the tripartite split-GFP association and dual-intein-mediated cleavage of polyprotein precursor is feasible in stably transformed Arabidopsis plants. Our results provide a proof-of-concept implementation of the tripartite split-GFP system as a potential tool for membrane PPI screens in planta.","tobacco","生物系におけるタンパク質間相互作用（PPI）の特定に大きな関心が寄せられているにもかかわらず、プランタでの大規模なPPIスクリーニングはわずかな試みしか行われていません。生化学的アッセイとは異なり、二分子蛍光補完により、細胞内分解能でインビボで一過性および弱いPPIを視覚化することができます。ただし、非蛍光フラグメントが高度に発現している場合、分割された半分の自発的で不可逆的な自己組織化により、誤検出が発生しやすくなります。最近開発された三者分割GFPシステムは、哺乳類および酵母細胞において信頼できるPPIレポーターであることが示されました。この研究では、この方法論をベータエストラジオール誘導性発現カセットと組み合わせて、プランタの膜PPIの検出に適合させました。ニコチアナベンタミアナの葉のアグロインフィルトレーションによる一過性発現アッセイを使用して、植物細胞における三者分割GFP会合の有用性を実証し、コンパートメントに容易にアクセスできる豊富な融合タンパク質があっても、三者分割GFPシステムが偽のバックグラウンドシグナルを生成しないことを確認します。相互作用の。リン酸ホメオスタシスに関係する膜PPIを含むいくつかのアラビドプシスPPIを検証することにより、プランタのさまざまな細胞区画でPPIを検出するためのこのアッセイの忠実度を証明しました。さらに、三者分割GFP会合とポリタンパク質前駆体のデュアルインテイン媒介切断を組み合わせた技術は、安定して形質転換されたアラビドプシス植物において実行可能である。私たちの結果は、プランタの膜PPIスクリーンの潜在的なツールとしての三者分割GFPシステムの概念の証明の実装を提供します。"]
[163,30410568,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","human Granulocyte-Colony Stimulating Factor","Plant methods","Transient co-expression with three O-glycosylation enzymes allows production of GalNAc-O-glycosylated Granulocyte-Colony Stimulating Factor in N. benthamiana.",2018,"14:98","[Ramirez-Alanis IA et al.]","Tecnologico de Monterrey, Monterrey, NL, Mexico.",30410568,"10.1186/s13007-018-0363-y ","Background: Expression of economically relevant proteins in alternative expression platforms, especially plant expression platforms, has gained significant interest in recent years. A special interest in working with plants as bioreactors for the production of pharmaceutical proteins is related to low production costs, product safety and quality. Among the different properties that plants can also offer for the production of recombinant proteins, protein glycosylation is crucial since it may have an impact on pharmaceutical functionality and/or stability. Results: The pharmaceutical glycoprotein human Granulocyte-Colony Stimulating Factor was transiently expressed in Nicotiana benthamiana plants and subjected to mammalian-specific mucin-type O-glycosylation by co-expressing the pharmaceutical protein together with the glycosylation machinery responsible for such post-translational modification. Conclusions: The  pharmaceutical glycoprotein human Granulocyte-Colony Stimulating Factor can be expressed in N. benthamiana plants via agroinfiltration with its native mammalian-specific mucin-type O-glycosylation.","tobacco","背景：代替発現プラットフォーム、特に植物発現プラットフォームでの経済的に関連するタンパク質の発現は、近年大きな関心を集めています。医薬品タンパク質の生産のためのバイオリアクターとして植物を扱うことへの特別な関心は、低い生産コスト、製品の安全性および品質に関連しています。植物が組換えタンパク質の生産のために提供できるさまざまな特性の中で、タンパク質のグリコシル化は、医薬品の機能性および/または安定性に影響を与える可能性があるため、非常に重要です。結果：医薬糖タンパク質ヒト顆粒球コロニー刺激因子は、ニコチアナベンタミアナ植物で一過性に発現され、そのような翻訳後修飾に関与するグリコシル化機構と一緒に医薬タンパク質を共発現することにより、哺乳動物特異的ムチン型O-グリコシル化を受けた。結論：医薬品糖タンパク質であるヒト顆粒球コロニー刺激因子は、その天然の哺乳類特異的ムチン型O-グリコシル化によるアグロインフィルトレーションを介してベンサミアナタバコ植物で発現することができます。"]
[164,30159002,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","GUS (beta-glucuronidase)","Plant methods","Improving agroinfiltration-based transient gene expression in Nicotiana benthamiana.",2018,"14:71","[Norkunas K et al.]","Queensland University of Technology, Brisbane, QLD, Australia.",30159002,"10.1186/s13007-018-0343-2 ","Background: Agroinfiltration is a simple and effective method of delivering transgenes into plant cells for the rapid production of recombinant proteins and  has become the preferred transient expression platform to manufacture biologics in plants. Despite its popularity, few studies have sought to improve the efficiency of agroinfiltration to further increase protein yields. This study aimed to increase agroinfiltration-based transient gene expression in Nicotiana benthamiana by improving all levels of transgenesis. Results: Using the benchmark pEAQ-HT deconstructed virus vector system and the GUS reporter enzyme, physical,  chemical, and molecular features were independently assessed for their ability to enhance Agrobacterium-mediated transformation and improve protein production capacities. Optimal Agrobacterium strain, cell culture density and co-cultivation time for maximal transient GUS (beta-glucuronidase) expression were established.  The effects of chemical additives in the liquid infiltration media were investigated and acetosyringone (500 muM), the antioxidant lipoic acid (5 muM), and a surfactant Pluronic F-68 (0.002%) were all shown to significantly increase  transgene expression. Gene products known to suppress post-transcriptional gene silencing, activate cell cycle progression and confer stress tolerance were also  assessed by co-expression. A simple 37 degrees C heat shock to plants, 1-2 days post infiltration, was shown to dramatically increase GUS reporter levels. By combining the most effective features, a dual vector delivery system was developed that provided approximately 3.5-fold higher levels of absolute GUS protein compared to the pEAQ-HT platform. Conclusions: In this paper, different strategies were assessed and optimised with the aim of increasing plant-made protein capacities in Nicotiana benthamiana using agroinfiltration. Chemical additives, heat shock and the co-expression of genes known to suppress stress and gene silencing or stimulate cell cycle progression were all proven to increase agroinfiltration-based transient gene expression. By combining the most effective of these elements a novel expression platform was developed capable of producing  plant-made protein at a significantly higher level than a benchmark hyper-expression system.","tobacco","背景：アグロインフィルトレーションは、組換えタンパク質を迅速に生産するために導入遺伝子を植物細胞に送達する簡単で効果的な方法であり、植物で生物製剤を製造するための好ましい一過性発現プラットフォームになっています。その人気にもかかわらず、タンパク質収量をさらに増加させるためにアグロインフィルトレーションの効率を改善しようとした研究はほとんどありません。この研究は、すべてのレベルのトランスジェネシスを改善することにより、ニコチアナ・ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションベースの一過性遺伝子発現を増加させることを目的とした。結果：ベンチマークpEAQ-HT分解ウイルスベクターシステムとGUSレポーター酵素を使用して、物理的、化学的、および分子的特徴を、アグロバクテリウムを介した形質転換を強化し、タンパク質産生能力を改善する能力について個別に評価しました。最大の一過性GUS（ベータ-グルクロニダーゼ）発現のための最適なアグロバクテリウム株、細胞培養密度および共培養時間が確立された。液体浸透媒体中の化学添加物の影響が調査され、アセトシリンゴン（500 muM）、抗酸化リポ酸（5 muM）、および界面活性剤Pluronic F-68（0.002％）はすべて、導入遺伝子の発現を有意に増加させることが示されました。転写後遺伝子サイレンシングを抑制し、細胞周期の進行を活性化し、ストレス耐性を付与することが知られている遺伝子産物も、共発現によって評価されました。浸潤後1〜2日の、植物への単純な37℃の熱ショックは、GUSレポーターレベルを劇的に増加させることが示されました。最も効果的な機能を組み合わせることにより、pEAQ-HTプラットフォームと比較して約3.5倍高いレベルの絶対GUSタンパク質を提供するデュアルベクターデリバリーシステムが開発されました。結論：この論文では、アグロインフィルトレーションを使用してニコチアナベンタミアナの植物製タンパク質容量を増加させることを目的として、さまざまな戦略を評価および最適化しました。化学添加物、熱ショック、およびストレスと遺伝子サイレンシングを抑制したり、細胞サイクルの進行を刺激したりすることが知られている遺伝子の共発現はすべて、アグロインフィルトレーションベースの一過性遺伝子発現を増加させることが証明されました。これらの要素の中で最も効果的なものを組み合わせることにより、ベンチマークの過剰発現システムよりも大幅に高いレベルで植物製タンパク質を生産できる新しい発現プラットフォームが開発されました。"]
[165,30452463,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","51-nt unstructured region (USR) ","PLoS pathogens","RNA virus evasion of nonsense-mediated decay.",2018,"14(11):e1007459","[May JP et al.]","University of Maryland-College Park, College Park, MD, USA.",30452463,"10.1371/journal.ppat.1007459 ","Nonsense-mediated decay (NMD) is a host RNA control pathway that removes aberrant transcripts with long 3' untranslated regions (UTRs) due to premature termination codons (PTCs) that arise through mutation or defective splicing. To maximize coding potential, RNA viruses often contain internally located stop codons that should also be prime targets for NMD. Using an agroinfiltration-based NMD assay in Nicotiana benthamiana, we identified two segments conferring NMD-resistance in the carmovirus Turnip crinkle virus (TCV) genome. The ribosome readthrough structure just downstream of the TCV p28 termination codon stabilized an NMD-sensitive reporter as did a frameshifting element from umbravirus Pea enation mosaic virus. In addition, a 51-nt unstructured region (USR) at the beginning of  the TCV 3' UTR increased NMD-resistance 3-fold when inserted into an unrelated NMD-sensitive 3' UTR. Several additional carmovirus 3' UTRs also conferred varying levels of NMD resistance depending on the construct despite no sequence similarity in the analogous region. Instead, these regions displayed a marked lack of RNA structure immediately following the NMD-targeted stop codon. NMD-resistance was only slightly reduced by conversion of 19 pyrimidines in the USR to purines, but resistance was abolished when a 2-nt mutation was introduced  downstream of the USR that substantially increased the secondary structure in the USR through formation of a stable hairpin. The same 2-nt mutation also enhanced the NMD susceptibility of a subgenomic RNA expressed independently of the genomic RNA. The conserved lack of RNA structure among most carmoviruses at the 5' end of their 3' UTR could serve to enhance subgenomic RNA stability, which would increase expression of the encoded capsid protein that also functions as the RNA  silencing suppressor. These results demonstrate that the TCV genome has features  that are inherently NMD-resistant and these strategies could be widespread among  RNA viruses and NMD-resistant host mRNAs with long 3' UTRs.","tobacco","ナンセンス媒介崩壊（NMD）は、変異またはスプライシングの欠陥によって生じる早期終了コドン（PTC）に起因する、長い3 '非翻訳領域（UTR）を持つ異常な転写物を除去するホストRNA制御経路です。コーディングの可能性を最大化するために、RNAウイルスには、NMDの主要なターゲットでもあるはずの内部に位置する停止コドンが含まれていることがよくあります。ニコチアナベンタミアナでアグロインフィルトレーションベースのNMDアッセイを使用して、カルモウイルスのカブクリンクルウイルス（TCV）ゲノムにNMD耐性を付与する2つのセグメントを特定しました。TCV p28ターミネーションコドンのすぐ下流にあるリボソームリードスルー構造は、アンブラウイルスPea enationモザイクウイルスからのフレームシフト要素と同様に、NMD感受性レポーターを安定させました。さらに、TCV 3'UTRの開始時に51ntの非構造化領域（USR）を使用すると、無関係のNMDに敏感な3 'UTRに挿入すると、NMD耐性が3倍に増加しました。いくつかの追加のカルモウイルス3'UTRも、類似領域に配列類似性がないにもかかわらず、構築物に応じてさまざまなレベルのNMD耐性を付与しました。代わりに、これらの領域は、NMDをターゲットとした停止コドンの直後にRNA構造の著しい欠如を示しました。NMD耐性は、USRの19個のピリミジンをプリンに変換することによってわずかに減少しましたが、USRの下流に2 ntの変異が導入され、安定したヘアピンの形成を通じてUSRの二次構造が大幅に増加すると、耐性がなくなりました。同じ2ntの変異は、ゲノムRNAとは独立して発現するサブゲノムRNAのNMD感受性も増強しました。3'UTRの5 '末端にあるほとんどのカルモウイルスのRNA構造の保存された欠如は、サブゲノムRNAの安定性を高めるのに役立ち、RNAサイレンシングサプレッサーとしても機能するコード化されたキャプシドタンパク質の発現を増加させます。これらの結果は、TCVゲノムが本質的にNMD耐性である特徴を持っており、これらの戦略が長い3'UTRを持つRNAウイルスおよびNMD耐性宿主mRNAの間で広まる可能性があることを示しています。"]
[166,29327438,"plant","Nicotiana benthamiana; Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","FnCas9 and sgRNA specific for the cucumber mosaic virus (CMV) or tobacco mosaic virus (TMV)","Plant biotechnology journal","Establishing RNA virus resistance in plants by harnessing CRISPR immune system.",2018,"16(8):1415-1423","[Zhang T  et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong, China.",29327438,"10.1111/pbi.12881 ","Recently, CRISPR-Cas (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins) system has been used to produce plants resistant to DNA virus infections. However, there is no RNA virus control method  in plants that uses CRISPR-Cas system to target the viral genome directly. Here,  we reprogrammed the CRISPR-Cas9 system from Francisella novicida to confer molecular immunity against RNA viruses in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis plants. Plants expressing FnCas9 and sgRNA specific for the cucumber mosaic virus (CMV) or tobacco mosaic virus (TMV) exhibited significantly attenuated virus infection symptoms and reduced viral RNA accumulation. Furthermore, in the transgenic virus-targeting plants, the resistance was inheritable and the progenies showed significantly less virus accumulation. These data reveal that the CRISPR/Cas9 system can be used to produce plant that stable resistant to RNA  viruses, thereby broadening the use of such technology for virus control in agricultural field.","tobacco","最近、CRISPR-Cas（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート-CRISPR関連タンパク質）システムが、DNAウイルス感染に耐性のある植物を生産するために使用されています。ただし、CRISPR-Casシステムを使用してウイルスゲノムを直接ターゲットにする植物には、RNAウイルス制御方法はありません。ここでは、フランシセラノビシダからCRISPR-Cas9システムを再プログラムして、ニコチアナベンサミアナおよびシロイヌナズナ植物にRNAウイルスに対する分子免疫を付与しました。キュウリモザイクウイルス（CMV）またはタバコモザイクウイルス（TMV）に特異的なFnCas9およびsgRNAを発現する植物は、ウイルス感染症状を大幅に軽減し、ウイルスRNAの蓄積を減少させました。さらに、トランスジェニックウイルス標的植物では、耐性は遺伝性であり、子孫はウイルスの蓄積が有意に少なかった。これらのデータは、CRISPR / Cas9システムを使用して、RNAウイルスに対して安定した耐性を持つ植物を生産できることを示しています。これにより、農業分野でのウイルス制御のためのそのような技術の使用が広がります。"]
[167,30289378,"plant","Nicotiana benthamiana; tomato","CRISPR;Cas9;"," ","Plant signaling & behavior","Engineering resistance against Tomato yellow leaf curl virus via the CRISPR/Cas9  system in tomato.",2018,"13(10):e1525996","[Tashkandi M et al.]","King Abdullah University of Science and Technology , Thuwal , Saudi Arabia.",30289378,"10.1080/15592324.2018.1525996 ","CRISPR/Cas systems confer molecular immunity against phages and conjugative plasmids in prokaryotes. Recently, CRISPR/Cas9 systems have been used to confer interference against eukaryotic viruses. Here, we engineered Nicotiana benthamiana and tomato (Solanum lycopersicum) plants with the CRISPR/Cas9 system  to confer immunity against the Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Targeting the TYLCV genome with Cas9-single guide RNA at the sequences encoding the coat protein (CP) or replicase (Rep) resulted in efficient virus interference, as evidenced by low accumulation of the TYLCV DNA genome in the transgenic plants. The CRISPR/Cas9-based immunity remained active across multiple generations in the N. benthamiana and tomato plants. Together, our results confirmed the efficiency  of the CRISPR/Cas9 system for stable engineering of TYLCV resistance in N. benthamiana and tomato, and opens the possibilities of engineering virus resistance against single and multiple infectious viruses in other crops.","tobacco","CRISPR / Casシステムは、原核生物のファージおよび結合プラスミドに対する分子免疫を付与します。最近、CRISPR / Cas9システムが真核生物ウイルスに対する干渉を与えるために使用されています。ここでは、ニコチアナ・ベンタミアナとトマト（Solanum lycopersicum）の植物をCRISPR / Cas9システムで設計し、トマト黄葉カールウイルス（TYLCV）に対する免疫を付与しました。トランスジェニック植物におけるTYLCVDNAゲノムの蓄積が少ないことから明らかなように、コートタンパク質（CP）またはレプリカーゼ（Rep）をコードする配列でCas9シングルガイドRNAを使用してTYLCVゲノムをターゲットにすると、効率的なウイルス干渉が生じました。CRISPR / Cas9ベースの免疫は、N。ベンタミアナとトマト植物の複数の世代にわたってアクティブなままでした。一緒に、私たちの結果は、N。ベンタミアナとトマトのTYLCV耐性の安定したエンジニアリングのためのCRISPR / Cas9システムの効率を確認し、他の作物の単一および複数の感染性ウイルスに対するウイルス耐性をエンジニアリングする可能性を開きます。"]
[168,28387986,"plant","Nicotiana occidentalis","Agroinfiltration;","GFLV-F13 protein 2A(HP) fused to an enhanced green fluorescent protein (EGFP) tag","Molecular plant pathology","The 50 distal amino acids of the 2A(HP) homing protein of Grapevine fanleaf virus elicit a hypersensitive reaction on Nicotiana occidentalis.",2018,"19(3):731-743","[Martin IR et al.]","Universite de Strasbourg, INRA, Colmar, France.",28387986,"10.1111/mpp.12558 ","Avirulence factors are critical for the arm's race between a virus and its host in determining incompatible reactions. The response of plants to viruses from the genus Nepovirus in the family Secoviridae, including Grapevine fanleaf virus (GFLV), is well characterized, although the nature and characteristics of the viral avirulence factor remain elusive. By using infectious clones of GFLV strains F13 and GHu in a reverse genetics approach with wild-type, assortant and  chimeric viruses, the determinant of necrotic lesions caused by GFLV-F13 on inoculated leaves of Nicotiana occidentalis was mapped to the RNA2-encoded protein 2A(HP) , particularly to its 50 C-terminal amino acids. The necrotic response showed hallmark characteristics of a genuine hypersensitive reaction, such as the accumulation of phytoalexins, reactive oxygen species, pathogenesis-related protein 1c and hypersensitivity-related (hsr) 203J transcripts. Transient expression of the GFLV-F13 protein 2A(HP) fused to an enhanced green fluorescent protein (EGFP) tag in N. occidentalis by agroinfiltration was sufficient to elicit a hypersensitive reaction. In addition, the GFLV-F13 avirulence factor, when introduced in GFLV-GHu, which causes a compatible reaction on N. occidentalis, elicited necrosis and partially restricted the virus. This is the first identification of a nepovirus avirulence  factor that is responsible for a hypersensitive reaction in both the context of virus infection and transient expression.","tobacco","非病原性因子は、互換性のない反応を決定する上で、ウイルスとその宿主の間の軍拡競争にとって重要です。グレープバインファンリーフウイルス（GFLV）を含む、セコビリダエ科のネポウイルス属のウイルスに対する植物の反応はよく特徴付けられていますが、ウイルス非病原性因子の性質と特徴はとらえどころのないままです。GFLV株F13およびGHuの感染性クローンを、野生型、アソータント、およびキメラウイルスを用いた逆遺伝学アプローチで使用することにより、Nicotianaoccidentalisの接種葉上のGFLV-F13によって引き起こされる壊死性病変の決定因子をRNA2コード化タンパク質2Aにマッピングしました。 （HP）、特にその50のC末端アミノ酸。壊死反応は、フィトアレキシン、反応性酸素種、病因関連タンパク質1cおよび過敏症関連（hsr）203J転写物の蓄積など、本物の過敏反応の特徴的な特徴を示した。アグロインフィルトレーションによってN.occidentalisの強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグに融合されたGFLV-F13タンパク質2A（HP）の一過性発現は、過敏反応を誘発するのに十分でした。さらに、GFLV-F13非病原性因子がGFLV-GHuに導入されると、N。occidentalisに適合反応を引き起こし、壊死を誘発し、ウイルスを部分的に制限しました。これは、ウイルス感染と一過性発現の両方の状況で過敏反応の原因となるネポウイルス非病原性因子の最初の同定です。"]
[169,30622549,"plant","Nicotiana tabacum","Cas9;","NtNAC080","Frontiers in plant science","NAC Family Transcription Factors in Tobacco and Their Potential Role in Regulating Leaf Senescence.",2018,"9:1900","[Li W et al.]","Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao, China.",30622549,"10.3389/fpls.2018.01900 ","The NAC family is one of the largest families of plant-specific transcription factors (TFs) and NAC proteins play important regulatory roles in a variety of developmental and stress response processes in plants. Members of the NAC family  TFs have been shown to be important regulators of leaf senescence in a number of  plant species. Here we report the identification of the NAC family in tobacco (Nicotiana tabacum) and characterization of the potential role of some of the tobacco NAC TFs in regulating leaf senescence. A total of 154 NAC genes (NtNACs)  were identified and clustered together with the Arabidopsis NAC family into fifteen groups (a-o). Transcriptome data analysis followed by qRT-PCR validation  showed that the majority of the senescence-up-regulated NtNACs fall into subgroups NAC-b and f. A number of known senescence regulators from Arabidopsis also belong to these two subgroups. Among these senescence-up-regulated NtNACs, NtNAC080, a close homolog of AtNAP, is a positive regulator of leaf senescence. Overexpression of NtNAC080 caused early senescence in Arabidopsis leaves and NtNAC080 mutation induced by Cas9/gRNA in tobacco led to delayed leaf senescence.","tobacco","NACファミリーは、植物特異的転写因子（TF）の最大のファミリーの1つであり、NACタンパク質は、植物のさまざまな発達およびストレス応答プロセスにおいて重要な調節的役割を果たします。NACファミリーTFのメンバーは、多くの植物種における葉の老化の重要な調節因子であることが示されています。ここでは、タバコ（Nicotiana tabacum）におけるNACファミリーの同定と、葉の老化の調節におけるいくつかのタバコNACTFの潜在的な役割の特徴を報告します。合計154のNAC遺伝子（NtNAC）が特定され、Arabidopsis NACファミリーとともに15のグループ（ao）にクラスター化されました。トランスクリプトームデータ分析とそれに続くqRT-PCR検証により、老化が上方制御されたNtNACの大部分がサブグループNAC-bおよびfに分類されることが示されました。アラビドプシスからの多くの既知の老化調節因子もこれらの2つのサブグループに属しています。これらの老化が上方制御されたNtNACの中で、AtNAPの密接な相同体であるNtNAC080は、葉の老化の正の調節因子です。NtNAC080の過剰発現はシロイヌナズナの葉の早期老化を引き起こし、タバコのCas9 / gRNAによって誘発されたNtNAC080突然変異は葉の老化の遅延を引き起こしました。"]
[170,29230929,"plant","Nicotiana tabacum","CRISPR;Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single-cell mutation detection to mutant plant regeneration.",2018,"16(7):1295-1310","[Lin CS  et al.]","Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.",29230929,"10.1111/pbi.12870 ","Plant protoplasts are useful for assessing the efficiency of clustered regularly  interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) mutagenesis. We improved the process of protoplast isolation and transfection of  several plant species. We also developed a method to isolate and regenerate single mutagenized Nicotianna tabacum protoplasts into mature plants. Following transfection of protoplasts with constructs encoding Cas9 and sgRNAs, target gene DNA could be amplified for further analysis to determine mutagenesis efficiency.  We investigated N. tabacum protoplasts and derived regenerated plants for targeted mutagenesis of the phytoene desaturase (NtPDS) gene. Genotyping of albino regenerants indicated that all four NtPDS alleles were mutated in amphidiploid tobacco, and no Cas9 DNA could be detected in most regenerated plants.","tobacco","植物プロトプラストは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）突然変異誘発の効率を評価するのに役立ちます。いくつかの植物種のプロトプラストの単離とトランスフェクションのプロセスを改善しました。また、単一の変異誘発されたNicotiannatabacumプロトプラストを単離して成熟植物に再生する方法を開発しました。Cas9およびsgRNAをコードするコンストラクトでプロトプラストをトランスフェクトした後、変異誘発効率を決定するためのさらなる分析のために、標的遺伝子DNAを増幅することができます。フィトエンデサチュラーゼ（NtPDS）遺伝子の標的突然変異誘発について、N。tabacumプロトプラストおよび派生した再生植物を調査しました。アルビノ再生剤のジェノタイピングは、4つのNtPDS対立遺伝子すべてが複二倍体タバコで変異しており、ほとんどの再生植物でCas9DNAを検出できなかったことを示しました。"]
[171,29555475,"plant","tobacco","Agroinfiltration;","green fluorescent protein (GFP)","Biochemical and biophysical research communications","Expression of T7-based constructs in tobacco cells.",2018,"499(2):196-201","[Sheen H et al.]","York University, Toronto, Ontario, Canada.",29555475,"10.1016/j.bbrc.2018.03.123 ","Bacteriophage T7 promoter and RNA polymerase (T7-Pol) are widely used for recombinant protein expression in bacteria. In plants, there exists conflicting results regarding the efficacy of protein expression from T7-Pol-derived mRNAs. To reconcile these contradictory observations, the expression of green fluorescent protein (GFP) from T7 constructs was evaluated in tobacco protoplasts. T7 constructs transcribed by a nuclearly targeted T7-Pol did not express GFP in plant protoplasts, however T7-Pol lacking a nuclear targeting signal was able to translate cytosolically transcribed mRNAs, but only if the messages contained a viral translation enhancer. GFP expression was further evaluated at the plant level by using agroinfiltration-mediated transient expression system. Unlike for cytosolic expression, nuclear T7 transcripts containing a viral translation enhancer element did not express GFP, and modifications designed to stabilize and facilitate export of T7 transcripts to the cytosol did not improve the expression. We conclude that expression of nuclear T7 constructs is not feasible in tobacco cells, but cytosolic transcription provides an alternative means to over-express RNAs directly in the  cytosol.","tobacco","バクテリオファージT7プロモーターとRNAポリメラーゼ（T7-Pol）は、細菌での組換えタンパク質の発現に広く使用されています。植物では、T7-Pol由来のmRNAからのタンパク質発現の有効性に関して相反する結果が存在します。これらの相反する観察結果を調整するために、T7コンストラクトからの緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現をタバコプロトプラストで評価しました。核標的化T7-Polによって転写されたT7構築物は、植物プロトプラストでGFPを発現しませんでしたが、核標的化シグナルを欠くT7-Polは、細胞質的に転写されたmRNAを翻訳できましたが、メッセージにウイルス翻訳エンハンサーが含まれている場合のみでした。GFP発現は、アグロインフィルトレーションを介した一過性発現システムを使用して、植物レベルでさらに評価されました。サイトゾル発現とは異なり、ウイルス翻訳エンハンサーエレメントを含む核T7転写物はGFPを発現せず、T7転写物のサイトゾルへの輸出を安定化および促進するように設計された修飾は発現を改善しませんでした。核T7構築物の発現はタバコ細胞では実行可能ではないと結論しますが、サイトゾル転写は、サイトゾルで直接RNAを過剰発現するための代替手段を提供します。"]
[172,29531752,"plant","tobacco","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase (PDS)","Horticulture research","A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants.",2018,"5:13","[Chen L et al.]","University of Connecticut, Storrs, CT, USA.",29531752,"10.1038/s41438-018-0023-4 ","Developing CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutants in asexually propagated perennial crop plants is challenging but highly desirable. Here, we report a highly useful method using an Agrobacterium-mediated transient CRISPR/Cas9 gene expression system to create non-transgenic mutant plants without the need for sexual segregation. We have also developed a rapid, cost-effective, and high-throughput mutant screening protocol based on Illumina sequencing followed by high-resolution melting (HRM) analysis. Using tetraploid tobacco as a model species and the phytoene desaturase (PDS) gene as a target, we successfully created and expediently identified mutant plants, which were verified as tetra-allelic mutants. We produced pds mutant shoots at a rate of 47.5% from tobacco leaf explants, without the use of antibiotic selection. Among these pds plants, 17.2% were confirmed to be non-transgenic, for an overall non-transgenic  mutation rate of 8.2%. Our method is reliable and effective in creating non-transgenic mutant plants without the need to segregate out transgenes through sexual reproduction. This method should be applicable to many economically important, heterozygous, perennial crop species that are more difficult to regenerate.","tobacco","無性繁殖した多年生作物でCRISPR / Cas9を介した非トランスジェニック変異体を開発することは困難ですが、非常に望ましいことです。ここでは、アグロバクテリウムを介した一過性CRISPR / Cas9遺伝子発現システムを使用して、性的分離を必要とせずに非トランスジェニック変異植物を作成する非常に有用な方法を報告します。また、Illuminaシーケンスとそれに続く高解像度融解（HRM）分析に基づいて、迅速で費用効果が高く、高スループットの変異体スクリーニングプロトコルを開発しました。モデル種として四倍体タバコを使用し、ターゲットとしてフィトエン不飽和化酵素（PDS）遺伝子を使用して、四対立遺伝子変異体として検証された変異体植物を作成し、適切に識別しました。抗生物質の選択を使用せずに、タバコの葉の外植片から47.5％の割合でpds変異体シュートを生成しました。これらのpds植物のうち、17.2％が非トランスジェニックであることが確認され、全体的な非トランスジェニック変異率は8.2％でした。私たちの方法は、有性生殖によって導入遺伝子を分離する必要なしに、非トランスジェニック突然変異植物を作成するのに信頼性が高く効果的です。この方法は、再生がより困難な、経済的に重要なヘテロ接合性の多年生作物種の多くに適用できるはずです。"]
[173,29614837,"plant","tobacco","CRISPR;Cas9;","carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) genes (NtCCD8A; NtCCD8B)","International journal of molecular sciences","CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Carotenoid Cleavage Dioxygenase 8 (CCD8) in Tobacco Affects Shoot and Root Architecture.",2018,"19(4)","[Gao J et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",29614837,"10.3390/ijms19041062 ","Strigolactones (SLs) are a class of phytohormones that regulate plant architecture. Carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) genes are involved in the biosynthesis of SLs and are identified and characterized in many plants. However, the function of CCD genes in tobacco remains poorly understood. In this study, two closely related genes NtCCD8A and NtCCD8B were cloned from tobacco (Nicotiana tabacum L.). The two NtCCD8 genes are orthologues of the tomato (Solanum lycopersicum) carotenoid cleavage dioxygenase 8 (SlCCD8) gene. NtCCD8A and NtCCD8B were primarily expressed in tobacco roots, but low expression levels of these genes were detected in all plant tissues, and their transcript levels significantly increased in response to phosphate limitation. NtCCD8A and NtCCD8B  mutations were introduced into tobacco using the CRISPR/Cas9 system and transgenic tobacco lines for both ntccd8 mutant alleles were identified. The ntccd8a and ntccd8b mutant alleles were inactivated by a deletion of three nucleotides and insertion of one nucleotide, respectively, both of which led to the production of premature stop codons. The ntccd8 mutants had increased shoot branching, reduced plant height, increased number of leaves and nodes, and reduced total plant biomass compared to wild-type plants; however, the root-to-shoot ratio was unchanged. In addition, mutant lines had shorter primary  roots and more of lateral roots than wild type. These results suggest that NtCCD8 genes are important for changes in tobacco plant architecture.","tobacco","ストリゴラクトン（SL）は、植物の構造を調節する植物ホルモンのクラスです。カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（CCD）遺伝子は、SLの生合成に関与しており、多くの植物で同定および特性評価されています。ただし、タバコのCCD遺伝子の機能はよくわかっていないままです。この研究では、2つの密接に関連する遺伝子NtCCD8AとNtCCD8Bがタバコ（Nicotiana tabacum L.）からクローン化されました。2つのNtCCD8遺伝子は、トマト（Solanum lycopersicum）のカロテノイド切断ジオキシゲナーゼ8（SlCCD8）遺伝子のオルソログです。NtCCD8AおよびNtCCD8Bは主にタバコの根で発現しましたが、これらの遺伝子の低い発現レベルがすべての植物組織で検出され、それらの転写レベルはリン酸制限に応答して有意に増加しました。NtCCD8AおよびNtCCD8B変異は、CRISPR / Cas9システムを使用してタバコに導入され、両方のntccd8変異対立遺伝子のトランスジェニックタバコ系統が同定されました。ntccd8aおよびntccd8b変異対立遺伝子は、それぞれ3つのヌクレオチドの削除と1つのヌクレオチドの挿入によって不活性化され、どちらも時期尚早の停止コドンの生成につながりました。ntccd8変異体は、野生型植物と比較して、シュートの分岐が増加し、草丈が減少し、葉と節の数が増加し、植物の総バイオマスが減少しました。ただし、根とシュートの比率は変わりませんでした。さらに、突然変異系統は野生型よりも一次根が短く、側根が多かった。これらの結果は、NtCCD8遺伝子がタバコ植物の構造の変化に重要であることを示唆しています。"]
[174,29524803,"plant","tobacco","Agroinfiltration;","prunasin hydrolases","Plant physiology and biochemistry","beta-Glucosidase activity in almond seeds.",2018,"126:163-172","[Del Cueto J et al.]","CEBAS-CSIC, Murcia, Spain.",29524803,"10.1016/j.plaphy.2017.12.028 ","Almond bitterness is the most important trait for breeding programs since bitter-kernelled seedlings are usually discarded. Amygdalin and its precursor prunasin are hydrolyzed by specific enzymes called beta-glucosidases. In order to better understand the genetic control of almond bitterness, some studies have shown differences in the location of prunasin hydrolases (PH, the beta-glucosidase that degrades prunasin) in sweet and bitter genotypes. The aim of this work was to isolate and characterize different PHs in sweet- and bitter-kernelled almonds to determine whether differences in their genomic or protein sequences are responsible for the sweet or bitter taste of their seeds. RNA was extracted from the tegument, nucellus and cotyledon of one sweet (Lauranne) and two bitter (D05-187 and S3067) almond genotypes throughout fruit ripening. Sequences of nine positive Phs were then obtained from all of the genotypes by RT-PCR and cloning. These clones, from mid ripening stage, were expressed in a heterologous system in tobacco plants by agroinfiltration. The PH  activity was detected using the Feigl-Anger method and quantifying the hydrogen cyanide released with prunasin as substrate. Furthermore, beta-glucosidase activity was detected by Fast Blue BB salt and Umbelliferyl method. Differences at the sequence level (SNPs) and in the activity assays were detected, although no correlation with bitterness was found.","tobacco","アーモンドの苦味は、苦い穀粒の苗木が通常廃棄されるため、繁殖プログラムにとって最も重要な特性です。アミグダリンとその前駆体であるプルナシンは、ベータグルコシダーゼと呼ばれる特定の酵素によって加水分解されます。アーモンドの苦味の遺伝的制御をよりよく理解するために、いくつかの研究では、甘い遺伝子型と苦い遺伝子型のプルナシン加水分解酵素（PH、プルナシンを分解するベータグルコシダーゼ）の位置の違いが示されています。この作業の目的は、甘いアーモンドと苦いアーモンドのさまざまなPHを分離して特性評価し、ゲノム配列またはタンパク質配列の違いが種子の甘い味または苦い味の原因であるかどうかを判断することでした。RNAは、果実の熟成を通して、1つの甘い（Lauranne）および2つの苦い（D05-187およびS3067）アーモンド遺伝子型の外皮、核および子葉から抽出されました。次に、RT-PCRとクローニングにより、すべての遺伝子型から9つの陽性Phの配列が得られました。これらのクローンは、熟成中期から、アグロインフィルトレーションによってタバコ植物の異種システムで発現されました。PH活性は、Feigl-Anger法を使用し、プルナシンを基質として放出されたシアン化水素を定量化して検出されました。さらに、ベータグルコシダーゼ活性は、ファストブルーBB塩およびアンベリフェリル法によって検出された。苦味との相関は見られなかったが、配列レベル（SNP）と活性アッセイの違いが検出された。"]
[175,29362090,"plant","tobacco","Agroinfiltration;","strawberry linalool/nerolidol synthase 1","Plant science","Nerolidol production in agroinfiltrated tobacco: Impact of protein stability and  membrane targeting of strawberry (Fragraria ananassa) NEROLIDOL SYNTHASE1.",2018,"267:112-123","[Andrade P et al.]","Center for Research in Agricultural Genomics, (CRAG) (CSIC-IRTA-UAB-UB), Barcelona, Spain.",29362090,"10.1016/j.plantsci.2017.11.013 ","The sesquiterpene alcohol nerolidol, synthesized from farnesyl diphosphate (FDP), mediates plant-insect interactions across multiple trophic levels with major implications for pest management in agriculture. We compared nerolidol engineering strategies in tobacco using agroinfiltration to transiently express strawberry (Fragraria ananassa) linalool/nerolidol synthase (FaNES1) either at the endoplasmic reticulum (ER) or in the cytosol as a soluble protein. Using solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GCMS), we have determined that FaNES1 directed to the ER via fusion to the transmembrane domain of squalene synthase or hydroxymethylglutaryl - CoA reductase displayed significant improvements in terms of transcript levels, protein accumulation, and volatile production when compared to its cytosolic form. However, the highest levels of nerolidol production were observed when FaNES1 was fused to GFP and expressed in the cytosol. This SPME-GCMS method afforded a limit of detection and quantification of 1.54 and 5.13pg, respectively. Nerolidol production levels, which ranged from 0.5 to 3.0mug/g F.W., correlated more strongly to the accumulation of recombinant protein than transcript level, the former being highest in FaNES-GFP transfected plants. These results indicate that while the ER may represent an enriched source of FDP that can be exploited in metabolic engineering, protein accumulation is a better predictor of sesquiterpene production.","tobacco","ファルネシル二リン酸（FDP）から合成されたセスキテルペンアルコールネロリドールは、農業における害虫管理に大きな影響を与える複数の栄養段階にわたる植物と昆虫の相互作用を仲介します。アグロインフィルトレーションを使用してタバコのネロリドール工学戦略を比較し、小胞体（ER）またはサイトゾルのいずれかで可溶性タンパク質としてイチゴ（Fragraria ananassa）リナロール/ネロリドールシンターゼ（FaNES1）を一時的に発現させました。固相マイクロ抽出およびガスクロマトグラフィー-質量分析（SPME-GCMS）を使用して、スクアレンシンターゼまたはヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼの膜貫通ドメインへの融合を介してERに向けられたFaNES1が転写レベル、タンパク質蓄積に関して有意な改善を示したことを確認しました、およびその細胞質ゾル形態と比較した場合の揮発性生成。ただし、FaNES1をGFPに融合させ、サイトゾルで発現させた場合に、最高レベルのネロリドール産生が観察されました。このSPME-GCMSメソッドでは、検出と定量の限界がそれぞれ1.54pgと5.13pgでした。0.5〜3.0mug / g FWの範囲のネロリドール生産レベルは、転写レベルよりも組換えタンパク質の蓄積とより強く相関し、前者はFaNES-GFPトランスフェクト植物で最も高かった。これらの結果は、ERが代謝工学で利用できるFDPの豊富な供給源を表している可能性がある一方で、タンパク質の蓄積がセスキテルペン産生のより良い予測因子であることを示しています。"]
[176,30018630,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;"," ","Frontiers in plant science","Efficient Multiplex Genome Editing Induces Precise, and Self-Ligated Type Mutations in Tomato Plants.",2018,"9:916","[Hashimoto R et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",30018630,"10.3389/fpls.2018.00916 ","Several expression systems for multiple guide RNA (gRNAs) have been developed in  the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) system to induce multiple-gene modifications in plants. Here, we evaluated mutation efficiencies in the tomato genome using multiplex CRISPR/Cas9 vectors consisting of various Cas9 expression promoters with multiple gRNA expression combinations. In transgenic tomato calli induced with these vectors, mutation patterns varied depending on the promoters used to express Cas9. By using the tomato ELONGATION FACTOR-1alpha (SlEF1alpha) promoter to drive Cas9, occurrence of various types of mutations with high efficiency was detected  in the tomato genome. Furthermore, sequence analysis showed that the majority of  mutations using the multiplex system with the SlEF1alpha promoter corresponded to specific mutation pattern of deletions produced by self-ligation at two target sites of CRISPR/Cas9 with low mosaic mutations. These results suggest that optimizing the Cas9 expression promoter used in CRISPR/Cas9-mediated mutation improves multiplex genome editing, and could be used effectively to disrupt functional domains precisely in the tomato genome.","tomato","複数のガイドRNA（gRNA）のいくつかの発現システムがCRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）システムで開発され、植物に複数の遺伝子の修飾を誘導します。ここでは、複数のgRNA発現の組み合わせを持つさまざまなCas9発現プロモーターからなるマルチプレックスCRISPR / Cas9ベクターを使用して、トマトゲノムの変異効率を評価しました。これらのベクターで誘導されたトランスジェニックトマトカルスでは、Cas9の発現に使用されるプロモーターによって変異パターンが異なりました。トマトELONGATIONFACTOR-1alpha（SlEF1alpha）プロモーターを使用してCas9を駆動することにより、トマトゲノムでさまざまなタイプの変異の発生が高効率で検出されました。さらに、配列分析は、SlEF1alphaプロモーターを備えたマルチプレックスシステムを使用した変異の大部分が、モザイク変異の少ないCRISPR / Cas9の2つの標的部位でのセルフライゲーションによって生成された欠失の特定の変異パターンに対応することを示しました。これらの結果は、CRISPR / Cas9を介した変異で使用されるCas9発現プロモーターを最適化すると、マルチプレックスゲノム編集が改善され、トマトゲノムの機能ドメインを正確に破壊するために効果的に使用できることを示唆しています。"]
[177,29755497,"plant","tomato","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","5 genes","Frontiers in plant science","Lycopene Is Enriched in Tomato Fruit by CRISPR/Cas9-Mediated Multiplex Genome Editing.",2018,"9:559","[Li X et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29755497,"10.3389/fpls.2018.00559 ","Numerous studies have been focusing on breeding tomato plants with enhanced lycopene accumulation, considering its positive effects of fruits on the visual and functional properties. In this study, we used a bidirectional strategy: promoting the biosynthesis of lycopene, while inhibiting the conversion from lycopene to beta- and alpha-carotene. The accumulation of lycopene was promoted by knocking down some genes associated with the carotenoid metabolic pathway. Finally, five genes were selected to be edited in genome by CRISPR/Cas9 system using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Our findings indicated that CRISPR/Cas9 is a site-specific genome editing technology that allows highly  efficient target mutagenesis in multiple genes of interest. Surprisingly, the lycopene content in tomato fruit subjected to genome editing was successfully increased to about 5.1-fold. The homozygous mutations were stably transmitted to  subsequent generations. Taken together, our results suggest that CRISPR/Cas9 system can be used for significantly improving lycopene content in tomato fruit with advantages such as high efficiency, rare off-target mutations, and stable heredity.","tomato","多くの研究は、視覚的および機能的特性に対する果物のプラスの効果を考慮して、リコピンの蓄積が強化されたトマト植物の繁殖に焦点を合わせてきました。この研究では、双方向戦略を使用しました。リコペンからベータカロチンおよびアルファカロテンへの変換を抑制しながら、リコペンの生合成を促進します。リコペンの蓄積は、カロテノイド代謝経路に関連するいくつかの遺伝子をノックダウンすることによって促進されました。最後に、Agrobacteriumtumefaciensを介した変換を使用したCRISPR / Cas9システムによってゲノム内で編集される5つの遺伝子が選択されました。私たちの調査結果は、CRISPR / Cas9が、関心のある複数の遺伝子で非常に効率的な標的突然変異誘発を可能にする部位特異的ゲノム編集技術であることを示しました。驚いたことに、ゲノム編集を行ったトマト果実のリコピン含有量は、約5.1倍に増加しました。ホモ接合変異は、次の世代に安定して伝達されました。まとめると、我々の結果は、CRISPR / Cas9システムがトマト果実のリコピン含有量を大幅に改善するために使用でき、高効率、まれなオフターゲット変異、安定した遺伝などの利点があることを示唆しています。"]
[178,30588320,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","NAC transcription factor  NOR-like1","Horticulture research","A NAC transcription factor, NOR-like1, is a new positive regulator of tomato fruit ripening.",2018,"5:75","[Gao Y et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30588320,"10.1038/s41438-018-0111-5 ","Ripening of the model fruit tomato (Solanum lycopersicum) is controlled by a transcription factor network including NAC (NAM, ATAF1/2, and CUC2) domain proteins such as No-ripening (NOR), SlNAC1, and SlNAC4, but very little is known  about the NAC targets or how they regulate ripening. Here, we conducted a systematic search of fruit-expressed NAC genes and showed that silencing NOR-like1 (Solyc07g063420) using virus-induced gene silencing (VIGS) inhibited specific aspects of ripening. Ripening initiation was delayed by 14 days when NOR-like1 function was inactivated by CRISPR/Cas9 and fruits showed obviously reduced ethylene production, retarded softening and chlorophyll loss, and reduced lycopene accumulation. RNA-sequencing profiling and gene promoter analysis suggested that genes involved in ethylene biosynthesis (SlACS2, SlACS4), color formation (SlGgpps2, SlSGR1), and cell wall metabolism (SlPG2a, SlPL, SlCEL2, and SlEXP1) are direct targets of NOR-like1. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR), and dual-luciferase reporter assay (DLR) confirmed that NOR-like1 bound to the promoters of these genes both in vitro and in vivo, and activated their expression. Our findings demonstrate that NOR-like1 is a new positive regulator of tomato fruit ripening, with an important role in the transcriptional regulatory network.","tomato","モデルフルーツトマト（Solanum lycopersicum）の熟成は、非熟成（NOR）、SlNAC1、SlNAC4などのNAC（NAM、ATAF1 / 2、CUC2）ドメインタンパク質を含む転写因子ネットワークによって制御されますが、ほとんど知られていません。 NACターゲットまたはそれらが熟成をどのように規制するかについて。ここでは、果物で発現したNAC遺伝子の体系的な検索を行い、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（VIGS）を使用したNOR-like1（Solyc07g063420）のサイレンシングが熟成の特定の側面を阻害することを示しました。NOR-like1機能がCRISPR / Cas9によって不活性化され、果実が明らかにエチレン生成の低下、軟化とクロロフィル損失の遅延、およびリコピン蓄積の低下を示した場合、成熟の開始は14日遅れました。RNAシーケンシングプロファイリングと遺伝子プロモーター分析は、エチレン生合成（SlACS2、SlACS4）、色形成（SlGgpps2、SlSGR1）、および細胞壁代謝（SlPG2a、SlPL、SlCEL2、およびSlEXP1）に関与する遺伝子がNOR-like1の直接の標的であることを示唆しました。 。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、クロマチン免疫沈降定量PCR（ChIP-qPCR）、およびデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（DLR）により、NOR-like1がinvitroおよびinvivoの両方でこれらの遺伝子のプロモーターに結合し、それらを活性化することが確認されました。式。私たちの調査結果は、NOR-like1がトマト果実の成熟の新しい正の調節因子であり、転写調節ネットワークにおいて重要な役割を果たしていることを示しています。"]
[179,30558146,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SlSBPASE)","International journal of molecular sciences","Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants.",2018,"19(12)","[Ding F et al.]","Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China.",30558146,"10.3390/ijms19124046 ","Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase) is an enzyme in the Calvin(-)Benson cycle and has been documented to be important in carbon assimilation, growth and  stress tolerance in plants. However, information on the impact of SBPase on carbon assimilation and nitrogen metabolism in tomato plants (Solanum lycopersicum) is rather limited. In the present study, we investigated the role of SBPase in carbon assimilation and nitrogen metabolism in tomato plants by knocking out SBPase gene SlSBPASE using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) gene editing technology. Compared with wild-type plants, slsbpase mutant plants displayed severe growth retardation. Further analyses showed that knockout of SlSBPASE led  to a substantial reduction in SBPase activity and as a consequence, ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) regeneration and carbon assimilation rate were dramatically inhibited in slsbpase mutant plants. It was further observed that much lower levels of sucrose and starch were accumulated in slsbpase mutant plants than their wild-type counterparts during the photoperiod. Intriguingly, mutation in SlSBPASE altered nitrogen metabolism as demonstrated by changes in levels of protein and amino acids and activities of nitrogen metabolic enzymes. Collectively, our data suggest that SlSBPASE is required for optimal growth, carbon assimilation and nitrogen metabolism in tomato plants.","tomato","セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ（SBPase）は、カルビン（-）ベンソンサイクルの酵素であり、植物の炭素同化、成長、ストレス耐性に重要であることが報告されています。ただし、トマト植物（Solanum lycopersicum）の炭素同化と窒素代謝に対するSBPaseの影響に関する情報はかなり限られています。本研究では、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）遺伝子編集技術を使用してSBPase遺伝子SlSBPASEをノックアウトすることにより、トマト植物の炭素同化と窒素代謝におけるSBPaseの役割を調査しました。野生型植物と比較して、slsbpase変異体植物は重度の成長遅延を示した。さらなる分析により、SlSBPASEのノックアウトにより、SBPase活性が大幅に低下し、その結果、slsbpase変異体植物ではリブロース-1,5-ビスホスフェート（RuBP）の再生と炭素同化率が劇的に阻害されることが示されました。さらに、光期間中に、野生型の対応物よりもはるかに低いレベルのスクロースおよびデンプンがslsbpase変異植物に蓄積されたことが観察された。興味深いことに、SlSBPASEの変異は、タンパク質とアミノ酸のレベルの変化、および窒素代謝酵素の活性によって示されるように、窒素代謝を変化させました。まとめると、私たちのデータは、SlSBPASEがトマト植物の最適な成長、炭素同化および窒素代謝に必要であることを示唆しています。"]
[180,30463360,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SlSBPASE)","International journal of molecular sciences","Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase is Involved in Methyl Jasmonate- and Dark-Induced Leaf Senescence in Tomato Plants.",2018,"19(11)","[Ding F et al.]","Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China.",30463360,"10.3390/ijms19113673 ","Leaf senescence represents the final stage of leaf development and is regulated by diverse internal and environmental factors. Jasmonates (JAs) have been demonstrated to induce leaf senescence in several species; however, the mechanisms of JA-induced leaf senescence remain largely unknown in tomato plants  (Solanum lycopersicum). In the present study, we tested the hypothesis that sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase), an enzyme functioning in the photosynthetic carbon fixation in the Calvin(-)Benson cycle, was involved in methyl jasmonate (MeJA)- and dark-induced leaf senescence in tomato plants. We found that MeJA and dark induced senescence in detached tomato leaves and concomitantly downregulated the expression of SlSBPASE and reduced SBPase activity. Furthermore, CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)-mediated mutagenesis of SlSBPASE led to senescence-associated characteristics in slsbpase mutant plants,  including loss of chlorophyll, repressed photosynthesis, increased membrane ion leakage, and enhanced transcript abundance of senescence-associated genes. Collectively, our data suggest that repression of SBPase by MeJA and dark treatment plays a role in JA- and dark-induced leaf senescence.","tomato","葉の老化は葉の発達の最終段階を表し、多様な内部および環境要因によって規制されています。ジャスモン酸類（JA）は、いくつかの種で葉の老化を誘発することが実証されています。ただし、JAによって誘発される葉の老化のメカニズムは、トマト植物（Solanum lycopersicum）ではほとんど不明なままです。本研究では、カルビン（-）ベンソンサイクルの光合成炭素固定で機能する酵素であるセドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ（SBPase）がジャスモン酸メチル（MeJA）-および暗-に関与しているという仮説を検証しました。トマト植物に誘発された葉の老化。MeJAと暗闇が分離したトマトの葉に老化を誘発し、同時にSlSBPASEの発現をダウンレギュレートし、SBPase活性を低下させることを発見しました。さらに、CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9）を介したSlSBPASEの突然変異誘発は、クロロフィルの喪失、光合成の抑制、膜イオン漏出の増加など、slsbpase突然変異植物の老化関連特性をもたらしました、および老化関連遺伝子の転写産物量の増加。まとめると、我々のデータは、MeJAによるSBPaseの抑制と暗所処理が、JAおよび暗所で誘発される葉の老化に役割を果たすことを示唆している。"]
[181,30272676,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","cis-regulatory regions or upstream open reading frames of genes associated with morphology, flower and fruit production, and ascorbic acid synthesis","Nature biotechnology","Domestication of wild tomato is accelerated by genome editing.",2018,null,"[Li T et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30272676,"10.1038/nbt.4273 ","Crop improvement by inbreeding often results in fitness penalties and loss of genetic diversity. We introduced desirable traits into four stress-tolerant wild-tomato accessions by using multiplex CRISPR-Cas9 editing of coding sequences, cis-regulatory regions or upstream open reading frames of genes associated with morphology, flower and fruit production, and ascorbic acid synthesis. Cas9-free progeny of edited plants had domesticated phenotypes yet retained parental disease resistance and salt tolerance.","tomato","近親交配による作物の改善は、しばしばフィットネスのペナルティと遺伝的多様性の喪失をもたらします。コーディング配列、シス調節領域、または形態、花と果実の生産、アスコルビン酸合成に関連する遺伝子の上流のオープンリーディングフレームのマルチプレックスCRISPR-Cas9編集を使用して、4つのストレス耐性野生トマトアクセッションに望ましい特性を導入しました。編集された植物のCas9を含まない子孫は、家畜化された表現型を持っていたが、親の耐病性と耐塩性を保持していた。"]
[182,29668051,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","plant-specific group D mitogen-activated protein kinase (SIMPK20)","New phytologist","Evidence for a specific and critical role of mitogen-activated protein kinase 20  in uni-to-binucleate transition of microgametogenesis in tomato.",2018,"219(1):176-194","[Chen L et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",29668051,"10.1111/nph.15150 ","(MAPKs) regulate diverse aspects of plant growth. However, their potential role in reproductive development remains elusive. Here, we discovered an unique role of SlMPK20, a plant-specific group D  MAPK, in pollen development in tomato. RNAi-mediated suppression of SlMPK20 or its knockout using CRISPR/Cas9 significantly reduced or completely abolished pollen viability, respectively, with no effects on maternal fertility. Cell biology and gene expression analyses established that SlMPK20 exerts its role specifically at the uni-to-binucleate transition during microgametogenesis. This  assertion is based on the findings that the transgenic pollen was largely arrested at the binucleate stage with the appearance of subcellular abnormality at the middle uninucleate microspore stage; and SlMPK20 mRNA and SlMPK20-GUS signals were localized in the tetrads, uninuclear microspores and binuclear pollen grains but not in microspore mother cells or mature pollen grains. Transcriptomic and proteomic analyses revealed that knockout of SlMPK20 significantly reduced the expression of a large number of genes controlling sugar and auxin metabolism and signaling in anthers. Finally, protein-protein interaction assays identified SlMYB32 as a putative target protein of SlMPK20. We conclude that SlMPK20 specifically regulates post-meiotic pollen development through modulating sugar and auxin metabolism and signaling.","tomato","（MAPK）は植物の成長の多様な側面を調節します。ただし、生殖の発達におけるそれらの潜在的な役割はとらえどころのないままです。ここでは、トマトの花粉の発達における、植物特異的なグループDMAPKであるSlMPK20のユニークな役割を発見しました。CRISPR / Cas9を使用したSlMPK20またはそのノックアウトのRNAiを介した抑制は、母体の生殖能力に影響を与えることなく、それぞれ花粉の生存率を大幅に低下または完全に無効にしました。細胞生物学および遺伝子発現分析は、SlMPK20が微小配偶子形成中の単核から二核への移行において特にその役割を発揮することを確立した。この主張は、トランスジェニック花粉が二核段階で大部分が停止し、中部の単核小胞子段階で細胞内異常が出現したという発見に基づいています。また、SlMPK20 mRNAおよびSlMPK20-GUSシグナルは、四分子、単核小胞子、および二核花粉粒に局在していましたが、小胞子母細胞または成熟花粉粒には局在していませんでした。トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析により、SlMPK20のノックアウトにより、葯の糖およびオーキシンの代謝とシグナル伝達を制御する多数の遺伝子の発現が大幅に減少することが明らかになりました。最後に、タンパク質-タンパク質相互作用アッセイにより、SlMYB32がSlMPK20の推定標的タンパク質として同定されました。SlMPK20は、糖とオーキシンの代謝とシグナル伝達を調節することにより、減数分裂後の花粉の発達を特異的に調節すると結論付けています。"]
[183,30107607,"plant","tomato","CRISPR;","BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (brz1)","Plant & cell physiology","BZR1 Transcription Factor Regulates Heat Stress Tolerance Through FERONIA Receptor-Like Kinase-Mediated Reactive Oxygen Species Signaling in Tomato.",2018,"59(11):2239-2254","[Yin Y et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",30107607,"10.1093/pcp/pcy146 ","BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1), the critical regulator of brassinosteroid (BR) response, participates in various BR-mediated developmental processes. However, the roles of BZR1 in stress tolerance are less clear. Here, we found that BZR1-like protein in tomato controls BR response and is involved in thermotolerance by regulating the FERONIA (FER) homologs. The CRISPR-bzr1 mutant  showed reduced growth and was not responsive to 24-epibrassinolide (EBR) with regard to the promotion of plant growth. Mutation in BZR1 impaired the induction  of RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG1 (RBOH1), production of H2O2 in the apoplast and heat tolerance. Exogenous H2O2 recovered the heat tolerance of the tomato bzr1 mutant. Overexpression of BZR1 enhanced the production of apoplastic H2O2 and heat stress responses. However, silencing of RBOH1 abolished the BZR1-mediated heat tolerance. Further analysis showed that BZR1 bound to the promoters of FERONIA2 (FER2) and FER3 and induced their expression. Silencing of  FER2/3 suppressed BZR1-dependent BR signaling for the induction of RBOH1 transcripts, accumulation of apoplastic H2O2 and heat tolerance. These results indicate that BZR1 regulates heat stress responses in tomato through RBOH1-dependent reactive oxygen species (ROS) signaling, which is at least partially mediated by FER2 and FER3.","tomato","ブラシノステロイド（BR）応答の重要な調節因子であるブラシノステロイド耐性1（BZR1）は、BRを介したさまざまな発達過程に関与しています。ただし、ストレス耐性におけるBZR1の役割はあまり明確ではありません。ここでは、トマトのBZR1様タンパク質がBR応答を制御し、FERONIA（FER）ホモログを調節することによって耐熱性に関与していることを発見しました。CRISPR-bzr1変異体は成長の低下を示し、植物成長の促進に関して24-エピブラシノリド（EBR）に反応しませんでした。BZR1の変異は、呼吸バーストオキシダーゼホモログ1（RBOH1）の誘導、アポプラストでのH2O2の生成、および耐熱性を損ないました。外因性H2O2は、トマトbzr1変異体の耐熱性を回復しました。BZR1の過剰発現は、アポプラスチックH2O2の生成と熱ストレス応答を強化しました。ただし、RBOH1のサイレンシングは、BZR1を介した耐熱性を廃止しました。さらなる分析は、BZR1がFERONIA2（FER2）およびFER3のプロモーターに結合し、それらの発現を誘導することを示した。FER2 / 3のサイレンシングは、RBOH1転写産物の誘導、アポプラスチックH2O2の蓄積、および耐熱性のためのBZR1依存BRシグナル伝達を抑制しました。これらの結果は、BZR1がRBOH1依存性反応性酸素種（ROS）シグナル伝達を介してトマトの熱ストレス応答を調節することを示しています。これは、少なくとも部分的にFER2およびFER3によって媒介されます。"]
[184,28640983,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","5 key genes in gamma-aminobutyric acid GABA production","Plant biotechnology journal","Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum.",2018,"16(2):415-427","[Li R et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",28640983,"10.1111/pbi.12781 ","In recent years, the type II CRISPR system has become a widely used and robust technique to implement site-directed mutagenesis in a variety of species including model and crop plants. However, few studies manipulated metabolic pathways in plants using the CRISPR system. Here, we introduced the pYLCRISPR/Cas9 system with one or two single-site guide RNAs to target the tomato phytoene desaturase gene. An obvious albino phenotype was observed in T0 regenerated plants, and more than 61% of the desired target sites were edited. Furthermore, we manipulated the gamma-aminobutyric acid (GABA) shunt in tomatoes  using a multiplex pYLCRISPR/Cas9 system that targeted five key genes. Fifty-three genome-edited plants were obtained following single plant transformation, and these samples represented single to quadruple mutants. The GABA accumulation in both the leaves and fruits of genomically edited lines was significantly enhanced, and the GABA content in the leaves of quadruple mutants was 19-fold higher than that in wild-type plants. Our data demonstrate that the multiplex CRISPR/Cas9 system can be exploited to precisely edit tomato genomic sequences and effectively create multisite knockout mutations, which could shed new light on plant metabolic engineering regulations.","tomato","近年、タイプII CRISPRシステムは、モデル植物や作物植物を含むさまざまな種で部位特異的突然変異誘発を実施するために広く使用され、堅牢な技術になりました。ただし、CRISPRシステムを使用して植物の代謝経路を操作した研究はほとんどありません。ここでは、トマトのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を標的とする1つまたは2つのシングルサイトガイドRNAを備えたpYLCRISPR / Cas9システムを紹介しました。明らかなアルビノ表現型がT0再生植物で観察され、目的の標的部位の61％以上が編集されました。さらに、5つの主要な遺伝子を対象としたマルチプレックスpYLCRISPR / Cas9システムを使用して、トマトのガンマアミノ酪酸（GABA）シャントを操作しました。単一の植物の形質転換後に53のゲノム編集植物が得られ、これらのサンプルは単一から四重の変異体を表した。ゲノム編集された系統の葉と果実の両方でのGABA蓄積は有意に増強され、4重変異体の葉のGABA含有量は野生型植物のそれより19倍高かった。私たちのデータは、マルチプレックスCRISPR / Cas9システムを利用して、トマトのゲノム配列を正確に編集し、マルチサイトのノックアウト変異を効果的に作成できることを示しています。これにより、植物の代謝工学規制に新たな光を当てることができます。"]
[185,29875274,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","Slddm1a; Slddm1b","Plant cell","Redistribution of CHH Methylation and Small Interfering RNAs across the Genome of Tomato ddm1 Mutants.",2018,"30(7):1628-1644","[Corem S  et al.]","Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion, Israel.",29875274,"10.1105/tpc.18.00167 ","In plants, cytosine methylation, an epigenetic mark critical for transposon silencing, is maintained over generations by key enzymes that directly methylate  DNA and is facilitated by chromatin remodelers, like DECREASE IN DNA METHYLATION1 (DDM1). Short-interfering RNAs (siRNAs) also mediate transposon DNA methylation through a process called RNA-directed DNA methylation (RdDM). In tomato (Solanum  lycopersicum), siRNAs are primarily mapped to gene-rich chromosome arms, and not  to pericentromeric regions as in Arabidopsis thaliana Tomato encodes two DDM1 genes. To better understand their functions and interaction with the RdDM pathway, we targeted the corresponding genes via the CRISPR/Cas9 technology, resulting in the isolation of Slddm1a and Slddm1b knockout mutants. Unlike the single mutants, Slddm1a Slddm1b double mutant plants display pleiotropic vegetative and reproductive phenotypes, associated with severe hypomethylation of the heterochromatic transposons in both the CG and CHG methylation contexts. The  methylation in the CHH context increased for some heterochromatic transposons and conversely decreased for others localized in euchromatin. We found that the number of heterochromatin-associated siRNAs, including RdDM-specific small RNAs,  increased significantly, likely limiting the transcriptional reactivation of transposons in Slddm1a Slddm1b Taken together, we propose that the global production of siRNAs and the CHH methylation mediated by the RdDM pathway are restricted to chromosome arms in tomato. Our data suggest that both pathways are  greatly enhanced in heterochromatin when DDM1 functions are lost, at the expense  of silencing mechanisms normally occurring in euchromatin.","tomato","植物では、トランスポゾンサイレンシングに重要なエピジェネティックマークであるシトシンメチル化は、DNAを直接メチル化する重要な酵素によって世代を超えて維持され、DECREASE IN DNA METHYLATION1（DDM1）などのクロマチンリモデラーによって促進されます。短鎖干渉RNA（siRNA）は、RNA指令DNAメチル化（RdDM）と呼ばれるプロセスを通じてトランスポゾンDNAメチル化も仲介します。トマト（Solanum lycopersicum）では、siRNAは主に遺伝子が豊富な染色体アームにマッピングされ、Arabidopsisthalianaのようにセントロメア周辺領域にはマッピングされません。トマトは2つのDDM1遺伝子をコードします。それらの機能とRdDM経路との相互作用をよりよく理解するために、CRISPR / Cas9テクノロジーを介して対応する遺伝子を標的とし、Slddm1aおよびSlddm1bノックアウト変異体を単離しました。単一変異体とは異なり、Slddm1a Slddm1b二重変異体植物は、CGおよびCHGメチル化のコンテキストの両方で、異質染色質トランスポゾンの重度の低メチル化に関連する多面的な栄養および生殖表現型を示します。CHHコンテキストでのメチル化は、一部の異色トランスポゾンでは増加し、逆にユークロマチンに局在する他のトランスポゾンでは減少しました。RdDM特異的smallRNAを含むヘテロクロマチン関連siRNAの数が大幅に増加し、Slddm1a Slddm1bのトランスポゾンの転写再活性化を制限する可能性があることを発見しました。まとめると、siRNAのグローバルな生成とRdDMによって媒介されるCHHメチル化を提案します。経路はトマトの染色体アームに制限されています。私たちのデータは、ユークロマチンで通常発生するサイレンシングメカニズムを犠牲にして、DDM1機能が失われるとヘテロクロマチンで両方の経路が大幅に強化されることを示唆しています。"]
[186,30144341,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","SlMIR160; SlARF10/16/17","Plant journal","Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound  leaf and flower development.",2018,"96(4):855-868","[Damodharan S et al.]","University of California, Davis, Davis, CA, USA.",30144341,"10.1111/tpj.14073 ","miR160 adjusts auxin-mediated development by post-transcriptional regulation of the auxin response factors ARF10/16/17. In tomato, knockdown of miR160 (sly-miR160) suggested that it is required for auxin-driven leaf blade outgrowth, but whether additional developmental events are adjusted by sly-miR160 is not clear. Here, the SlMIR160 genes and the genes of its SlARFs targets were edited by CRISPR/Cas9 resulting in the isolation of loss-of-function mutants. In addition, hypomorphic mutants that accumulate variable reduced levels of sly-miR160a were isolated. We found that the loss-of-function mutants in SlMIR160a (CR-slmir160a-6/7) produced only four wiry leaves, whereas the hypomorphic mutants developed leaves and flowers with graded developmental abnormalities. Phenotypic severity correlated with the upregulation of SlARF10A.  Consistent with that, double mutants in SlMIR160a and SlARF10A restored leaf and  flower development indicating that over-accumulation of SlARF10A underlay the developmental abnormalities exhibited in the CR-slmir160a mutants. Phenotype severity also correlated with the upregulation of the SHOOT MERISTEMLESS homolog  Tomato Knotted 2, which in turn activated the transcription of the cytokinin biosynthesis genes SlIPT2 and SlIPT4. However, no change in Tomato Knotted 2 was  detected in the absence of SlARF10A, suggesting that it is upregulated due to auxin signaling suppression by SlARF10A. Knockout of sly-miR160a-targeted SlARFs  showed that whereas SlARF10A is indispensable for leaf blade outgrowth and floral organ patterning, the functions of SlARF16A and SlARF17 are redundant. Taken together our results suggest that sly-miR160a promotes blade outgrowth as well as leaf and leaflet initiation and floral organ development through the quantitative regulation of its major target SlARF10A.","tomato","miR160は、オーキシン応答因子ARF10 / 16/17の転写後調節により、オーキシンを介した発達を調整します。トマトでは、miR160（sly-miR160）のノックダウンにより、オーキシンによる葉身の成長に必要であることが示唆されましたが、sly-miR160によって追加の発生イベントが調整されるかどうかは明らかではありません。ここでは、SlMIR160遺伝子とそのSlARFターゲットの遺伝子が、CRISPR / Cas9によって編集され、機能喪失型変異体が分離されました。さらに、sly-miR160aの可変的な減少したレベルを蓄積するhypomorphic変異体が分離されました。SlMIR160a（CR-slmir160a-6 / 7）の機能喪失型変異体は、4つのワイリーの葉しか生成しなかったのに対し、低形態変異体は、段階的な発達異常を伴う葉と花を発達させた。表現型の重症度は、SlARF10Aのアップレギュレーションと相関していました。それと一致して、SlMIR160aとSlARF10Aの二重変異体は葉と花の発達を回復し、SlARF10Aの過剰蓄積がCR-slmir160a変異体で示された発達異常の根底にあることを示しています。表現型の重症度は、SHOOTMERISTEMLESSホモログであるTomatoKnotted 2のアップレギュレーションとも相関しており、サイトカイニン生合成遺伝子SlIPT2およびSlIPT4の転写を活性化しました。ただし、SlARF10Aがない場合、Tomato Knotted 2の変化は検出されませんでした。これは、SlARF10Aによるオーキシンシグナル伝達の抑制によりアップレギュレートされていることを示しています。sly-miR160aをターゲットとしたSlARFのノックアウトは、SlARF10Aが葉身の成長と花器官のパターン形成に不可欠であるのに対し、SlARF16AとSlARF17の機能は冗長であることを示しました。まとめると、sly-miR160aは、主要なターゲットであるSlARF10Aの定量的制御を通じて、ブレードの成長、葉と小葉の開始、花器官の発達を促進することが示唆されています。"]
[187,29668111,"plant","tomato","CRISPR;","caroteinoid isomerase; phytoene synthase 1","Plant journal","Efficient in planta gene targeting in tomato using geminiviral replicons and the  CRISPR/Cas9 system.",2018,"95(1):5-16","[Dahan-Meir T  et al.]","Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel.",29668111,"10.1111/tpj.13932 ","Current breeding relies mostly on random mutagenesis and recombination to generate novel genetic variation. However, targeted genome editing is becoming an increasingly important tool for precise plant breeding. Using the CRISPR-Cas system combined with the bean yellow dwarf virus rolling circle replicon, we optimized a method for targeted mutagenesis and gene replacement in tomato. The carotenoid isomerase (CRTISO) and phytoene synthase 1 (PSY1) genes from the carotenoid biosynthesis pathway were chosen as targets due to their easily detectable change of phenotype. We took advantage of the geminiviral replicon amplification as a means to provide a large amount of donor template for the repair of a CRISPR-Cas-induced DNA double-strand break (DSB) in the target gene,  via homologous recombination (HR). Mutagenesis experiments, performed in the Micro-Tom variety, achieved precise modification of the CRTISO and PSY1 loci at an efficiency of up to 90%. In the gene targeting (GT) experiments, our target was a fast-neutron-induced crtiso allele that contained a 281-bp deletion. This deletion was repaired with the wild-type sequence through HR between the CRISPR-Cas-induced DSB in the crtiso target and the amplified donor in 25% of the plants transformed. This shows that efficient GT can be achieved in the absence of selection markers or reporters using a single and modular construct that is adaptable to other tomato targets and other crops.","tomato","現在の育種は、主にランダムな突然変異誘発と組換えに依存して、新しい遺伝的変異を生み出しています。ただし、ターゲットを絞ったゲノム編集は、正確な植物育種のためのますます重要なツールになりつつあります。CRISPR-Casシステムをビーンイエロードワーフウイルスのローリングサークルレプリコンと組み合わせて使用​​し、トマトの標的突然変異誘発と遺伝子置換の方法を最適化しました。カロテノイド生合成経路からのカロテノイドイソメラーゼ（CRTISO）およびフィトエンシンターゼ1（PSY1）遺伝子は、表現型の変化を容易に検出できるため、ターゲットとして選択されました。ジェミニウイルスレプリコン増幅を利用して、相同組換え（HR）を介して、標的遺伝子のCRISPR-Cas誘導DNA二本鎖切断（DSB）を修復するための大量のドナーテンプレートを提供しました。Micro-Tom品種で実施された突然変異誘発実験は、最大90％の効率でCRTISOおよびPSY1遺伝子座の正確な修正を達成しました。遺伝子ターゲティング（GT）実験では、私たちのターゲットは、281bpの欠失を含む高速中性子誘導のcrtiso対立遺伝子でした。この削除は、crtisoターゲットのCRISPR-Cas誘導DSBと形質転換された植物の25％の増幅されたドナーとの間のHRを介して野生型配列で修復されました。これは、他のトマトターゲットや他の作物に適応できる単一のモジュール式構造を使用して、選択マーカーやレポーターがなくても効率的なGTを達成できることを示しています。"]
[188,29446503,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","long non-coding RNA (lncRNA1459)","Plant journal","CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of lncRNA1459 alters tomato fruit ripening.",2018,"94(3):513-524","[Li R et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29446503,"10.1111/tpj.13872 ","With the development of high-throughput sequencing, many long non-coding RNAs (lncRNAs) have been found to play important roles in diverse biological processes. However, the biological functions of most plant lncRNAs are still unknown. We have previously discovered a tomato ripening-related lncRNA, lncRNA1459. Here, we cloned the full-length lncRNA1459, giving two transcript isoforms. In addition, lncRNA1459 exhibited a specific location in the nucleus. Furthermore, in order to fully identify the function of lncRNA1459 in tomato ripening, loss-of-function mutants of lncRNA1459 were developed using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/-associated protein 9 (Cas9)-induced genome editing technology. Compared with wild-type fruits, the tomato ripening process was significantly repressed in lncRNA1459 mutants. Ethylene production and lycopene accumulation were largely repressed in lncRNA1459 mutants. Additionally, genes related to ethylene and carotenoid biosynthesis were distinctly downregulated in lncRNA1459 mutants compared with wild-type fruits. Moreover, expression of numerous ripening-related genes was changed significantly when lncRNA1459 was knocked out. Expression of potential tomato ripening-related lncRNAs was also specifically changed after knocking out  lncRNA1459. Taken together, these results provide insight into the role of lncRNA1459 in tomato fruit ripening.","tomato","ハイスループットシーケンシングの開発に伴い、多くの長い非コーディングRNA（lncRNA）が多様な生物学的プロセスで重要な役割を果たすことがわかっています。ただし、ほとんどの植物lncRNAの生物学的機能はまだ不明です。私たちは以前、トマトの熟成に関連するlncRNA、lncRNA1459を発見しました。ここでは、完全長のlncRNA1459のクローンを作成し、2つの転写物アイソフォームを作成しました。さらに、lncRNA1459は核内の特定の位置を示しました。さらに、トマトの熟成におけるlncRNA1459の機能を完全に特定するために、lncRNA1459の機能喪失変異体が、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（CRISPR）/関連タンパク質9（Cas9）誘導ゲノム編集技術を使用して開発されました。野生型の果実と比較して、トマトの成熟過程は、lncRNA1459変異体で有意に抑制されました。エチレンの生成とリコピンの蓄積は、lncRNA1459変異体で大幅に抑制されました。さらに、エチレンとカロテノイドの生合成に関連する遺伝子は、野生型の果実と比較して、lncRNA1459変異体で明らかにダウンレギュレートされていました。さらに、lncRNA1459がノックアウトされると、多数の成熟関連遺伝子の発現が大幅に変化しました。潜在的なトマト熟成関連lncRNAの発現も、lncRNA1459をノックアウトした後に特異的に変化しました。まとめると、これらの結果は、トマト果実の成熟におけるlncRNA1459の役割についての洞察を提供します。"]
[189,30521567,"plant","tomato","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","DFR; Nptll","PloS one","The DFR locus: A smart landing pad for targeted transgene insertion in tomato.",2018,"13(12):e0208395","[Danilo B  et al.]","INRA PACA, UR 1052, Avignon, France.",30521567,"10.1371/journal.pone.0208395 ","Targeted insertion of transgenes in plants is still challenging and requires further technical innovation. In the present study, we chose the tomato DFR gene  involved in anthocyanin biosynthesis as a landing pad for targeted transgene insertion using CRISPR-Cas9 in a two-step strategy. First, a 1013 bp was deleted  in the endogenous DFR gene. Hypocotyls and callus of in vitro regenerated plantlets homozygous for the deletion were green instead of the usual anthocyanin produced purple colour. Next, standard Agrobacterium-mediated transformation was  used to target transgene insertion at the DFR landing pad in the dfr deletion line. The single binary vector carried two sgRNAs, a donor template containing two homology arms of 400 bp, the previously deleted DFR sequence, and a NptII expression cassette. Regenerating plantlets were screened for a purple-colour phenotype indicating that DFR function had been restored. Targeted insertions were identified in 1.29% of the transformed explants. Thus, we established an efficient method for selecting HDR-mediated transgene insertion using the CRISPR-Cas9 system in tomato. The visual screen used here facilitates selection of these rare gene targeting events, does not necessitate the systematic PCR screening of all the regenerating material and can be potentially applied to other crops.","tomato","植物への導入遺伝子の標的挿入は依然として困難であり、さらなる技術革新が必要です。本研究では、アントシアニン生合成に関与するトマトDFR遺伝子を、2段階戦略でCRISPR-Cas9を使用した標的化トランス遺伝子挿入のランディングパッドとして選択しました。まず、内因性DFR遺伝子の1013bpが削除されました。欠失についてホモ接合性のインビトロで再生された小植物の低子葉およびカルスは、通常のアントシアニンが生成する紫色の代わりに緑色であった。次に、標準的なアグロバクテリウムを介した形質転換を使用して、dfr削除ラインのDFRランディングパッドでの導入遺伝子の挿入をターゲットにしました。単一のバイナリベクターは、2つのsgRNA、400 bpの2つの相同性アームを含むドナーテンプレート、以前に削除されたDFR配列、およびNptII発現カセットを搭載していました。再生中の小植物は、DFR機能が回復したことを示す紫色の表現型についてスクリーニングされた。形質転換された外植片の1.29％で標的挿入が同定された。したがって、トマトのCRISPR-Cas9システムを使用して、HDRを介した導入遺伝子の挿入を選択するための効率的な方法を確立しました。ここで使用される視覚的スクリーニングは、これらのまれな遺伝子ターゲティングイベントの選択を容易にし、すべての再生材料の体系的なPCRスクリーニングを必要とせず、他の作物に適用できる可能性があります。"]
[190,29797189,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","Psy1; CrtR-b2","Transgenic research","CRISPR/Cas9 editing of carotenoid genes in tomato.",2018,"27(4):367-378","[D'Ambrosio C  et al.]","Agenzia Lucana per lo Sviluppo e l'Innovazione in Agricoltura, Metaponto, Italy.",29797189,"10.1007/s11248-018-0079-9 ","CRISPR/Cas9 technology is rapidly spreading as genome editing system in crop breeding. The efficacy of CRISPR/Cas9 in tomato was tested on Psy1 and CrtR-b2, two key genes of carotenoid biosynthesis. Carotenoids are plant secondary metabolites that must be present in the diet of higher animals because they exert irreplaceable functions in important physiological processes. Psy1 and CrtR-b2 were chosen because their impairment is easily detectable as a change of fruit or flower color. Two CRISPR/Cas9 constructs were designed to target neighboring sequences on the first exon of each gene. Thirty-four out of forty-nine (69%) transformed plants showed the expected loss-of-function phenotypes due to the editing of both alleles of a locus. However, by including the seven plants edited only at one of the two homologs and showing a normal phenotype, the editing rate  reaches the 84%. Although none chimeric phenotype was observed, the cloning of target region amplified fragments revealed that in the 40% of analyzed DNA samples were present more than two alleles. As concerning the type of mutation, it was possible to identify 34 new different alleles across the four transformation experiments. The sequence characterization of the CRISPR/Cas9-induced mutations showed that the most frequent repair errors were the insertion and the deletion of one base. The results of this study prove that  the CRISPRCas9 system can be an efficient and quick method for the generation of  useful mutations in tomato to be implemented in breeding programs.","tomato","CRISPR / Cas9テクノロジーは、作物育種におけるゲノム編集システムとして急速に普及しています。トマトにおけるCRISPR / Cas9の有効性は、カロテノイド生合成の2つの重要な遺伝子であるPsy1とCrtR-b2でテストされました。カロテノイドは植物の二次代謝産物であり、重要な生理学的プロセスにおいてかけがえのない機能を発揮するため、高等動物の食事に存在しなければなりません。Psy1とCrtR-b2が選択されたのは、それらの障害が果物や花の色の変化として簡単に検出できるためです。2つのCRISPR / Cas9コンストラクトは、各遺伝子の最初のエキソン上の隣接する配列をターゲットにするように設計されました。49（69％）の形質転換植物のうち34は、遺伝子座の両方の対立遺伝子の編集により、予想される機能喪失の表現型を示しました。しかし、2つのホモログのうちの1つだけで編集された7つの植物を含め、正常な表現型を示すことにより、編集率は84％に達します。キメラ表現型は観察されなかったが、標的領域増幅断片のクローニングにより、分析されたDNAサンプルの40％に2つ以上の対立遺伝子が存在することが明らかになった。突然変異の種類に関しては、4つの形質転換実験で34の新しい異なる対立遺伝子を特定することができました。CRISPR / Cas9によって誘発された突然変異の配列特性は、最も頻繁な修復エラーが1つの塩基の挿入と削除であることを示しました。この研究の結果は、CRISPRCas9システムが育種プログラムで実施されるトマトの有用な突然変異を生成するための効率的かつ迅速な方法である可能性があることを証明しています。"]
[191,30096237,"plant","tomato (Solanum lycopersicum)","CRISPR;Cas9;","C-repeat binding factor (slcbf1)","Journal of agricultural and food chemistry","Reduction of Tomato-Plant Chilling Tolerance by CRISPR-Cas9-Mediated SlCBF1 Mutagenesis.",2018,"66(34):9042-9051","[Li R et al.]","China Agricultural University , Beijing , China.",30096237,"10.1021/acs.jafc.8b02177 ","Chilling stress is the main constraint in tomato ( Solanum lycopersicum) production, as this is a chilling-sensitive horticultural crop. The highly conserved C-repeat binding factors (CBFs) are cold-response-system components found in many species. In this study, we generated slcbf1 mutants using the CRISPR-Cas9 system and investigated the role of SlCBF1 in tomato-plant chilling tolerances. The slcbf1 mutants exhibited more severe chilling-injury symptoms with higher electrolyte leakage and malondialdehyde levels than wild-type (WT) plants. Additionally, slcbf1 mutants showed lower proline and protein contents and higher hydrogen peroxide contents and activities of antioxidant enzymes than  WT plants. Knockout of SlCBF1 significantly increased indole acetic acid contents but decreased methyl jasmonate, abscisic acid, and zeatin riboside contents. The  reduced chilling tolerance of the slcbf1 mutants was further reflected by the down-regulation of CBF-related genes. These results contribute to a better understanding of the molecular basis underlying SlCBF1 mediation of tomato chilling sensitivity.","tomato","トマト（Solanum lycopersicum）の生産では、低温に敏感な園芸作物であるため、低温ストレスが主な制約となります。高度に保存されたCリピート結合因子（CBF）は、多くの種に見られる低温応答システムの構成要素です。この研究では、CRISPR-Cas9システムを使用してslcbf1変異体を生成し、トマト植物の低温耐性におけるSlCBF1の役割を調査しました。slcbf1変異体は、野生型（WT）植物よりも高い電解質漏出とマロンジアルデヒドレベルを伴う、より重度の低温障害症状を示しました。さらに、slcbf1変異体は、WT植物よりも低いプロリンおよびタンパク質含有量、高い過酸化水素含有量、および抗酸化酵素の活性を示しました。SlCBF1のノックアウトは、インドール酢酸の含有量を大幅に増加させましたが、ジャスモン酸メチル、アブシジン酸、およびゼアチンリボシドの含有量を減少させました。slcbf1変異体の低温耐性の低下は、CBF関連遺伝子のダウンレギュレーションによってさらに反映されました。これらの結果は、トマトの低温感受性のSlCBF1媒介の根底にある分子基盤のより良い理解に貢献します。"]
[192,29206320,"plant","tomato (Solanum pennellii)","CRISPR;Cas9;","farnesyl pyrophosphate synthase 2","Plant journal","A farnesyl pyrophosphate synthase gene expressed in pollen functions in S-RNase-independent unilateral incompatibility.",2018,"93(3):417-430","[Qin X et al.]","University of California, Davis, CA, USA.",29206320,"10.1111/tpj.13796 ","Multiple independent and overlapping pollen rejection pathways contribute to unilateral interspecific incompatibility (UI). In crosses between tomato species, pollen rejection usually occurs when the female parent is self-incompatible (SI)  and the male parent self-compatible (SC) (the 'SI x SC rule'). Additional, as yet unknown, UI mechanisms are independent of self-incompatibility and contribute to  UI between SC species or populations. We identified a major quantitative trait locus on chromosome 10 (ui10.1) which affects pollen-side UI responses in crosses between cultivated tomato, Solanum lycopersicum, and Solanum pennelliiLA0716, both of which are SC and lack S-RNase, the pistil determinant of S-specificity in Solanaceae. Here we show that ui10.1 is a farnesyl pyrophosphate synthase gene (FPS2) expressed in pollen. Expression is about 18-fold higher in pollen of S. pennellii than in S. lycopersicum. Pollen with the hypomorphic S. lycopersicum allele is selectively eliminated on pistils of the F1 hybrid, leading to transmission ratio distortion in the F2 progeny. CRISPR/Cas9-generated knockout mutants (fps2) in S. pennelliiLA0716 are self-sterile due to pollen rejection, but mutant pollen is fully functional on pistils of S. lycopersicum. F2 progeny of S. lycopersicum x S. pennellii (fps2) show reversed transmission ratio distortion due to selective elimination of pollen bearing the knockout allele. Overexpression of FPS2 in S. lycopersicum pollen rescues the pollen elimination phenotype. FPS2-based pollen selectivity does not involve S-RNase and has not been previously linked to UI. Our results point to an entirely new mechanism of interspecific pollen rejection in plants.","tomato","複数の独立した重複する花粉拒絶経路は、片側の種間非互換性（UI）に寄与します。トマト種間の交配では、花粉拒絶は通常、女性の親が自己不適合（SI）であり、男性の親が自己適合（SC）である場合に発生します（「SIxSCルール」）。追加の、まだ不明なUIメ​​カニズムは、自己非互換性とは無関係であり、SCの種または集団間のUIに寄与します。培養トマト、Solanum lycopersicum、Solanum pennelliiLA0716の交配において、花粉側のUI応答に影響を与える、染色体10（ui10.1）上の主要な定量的特性遺伝子座を特定しました。どちらもSCであり、Pistil決定因子であるS-RNaseを欠いています。 SolanaceaeのS特異性。ここでは、ui10.1が花粉で発現するファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子（FPS2）であることを示します。S. lycopersicumよりもS.pennelliiの花粉の方が発現が約18倍高い。低形態のS.lycopersicum対立遺伝子を持つ花粉は、F1ハイブリッドのピストルで選択的に排除され、F2子孫の伝達比の歪みにつながります。S.pennelliiLA0716のCRISPR / Cas9生成ノックアウト変異体（fps2）は、花粉拒絶のために自己滅菌ですが、変異体花粉はS.lycopersicumの拳銃で完全に機能します。S. lycopersicum x S. pennellii（fps2）のF2子孫は、ノックアウト対立遺伝子を持つ花粉の選択的除去により、逆伝達率の歪みを示します。S. lycopersicum花粉におけるFPS2の過剰発現は、花粉除去表現型を救助します。FPS2ベースの花粉選択性はS-RNaseを含まず、以前はUIにリンクされていませんでした。私たちの結果は、植物における種間花粉拒絶の全く新しいメカニズムを示しています。"]
[193,30272678,"plant","tomato (Solanum pimpinellifolium)","CRISPR;Cas9;","6 loci","Nature biotechnology","De novo domestication of wild tomato using genome editing.",2018,null,"[Zsogon A  et al.]","Universidade Federal de Vicosa, Vicosa, Brazil.",30272678,"10.1038/nbt.4272 ","Breeding of crops over millennia for yield and productivity has led to reduced genetic diversity. As a result, beneficial traits of wild species, such as disease resistance and stress tolerance, have been lost. We devised a CRISPR-Cas9 genome engineering strategy to combine agronomically desirable traits with useful traits present in wild lines. We report that editing of six loci that are important for yield and productivity in present-day tomato crop lines enabled de  novo domestication of wild Solanum pimpinellifolium. Engineered S. pimpinellifolium morphology was altered, together with the size, number and nutritional value of the fruits. Compared with the wild parent, our engineered lines have a threefold increase in fruit size and a tenfold increase in fruit number. Notably, fruit lycopene accumulation is improved by 500% compared with the widely cultivated S. lycopersicum. Our results pave the way for molecular breeding programs to exploit the genetic diversity present in wild plants.","tomato","収量と生産性のために何千年にもわたって作物を育てることで、遺伝的多様性が減少しました。その結果、耐病性やストレス耐性などの野生種の有益な特性が失われています。CRISPR-Cas9ゲノムエンジニアリング戦略を考案し、農業的に望ましい形質と野生系統に存在する有用な形質を組み合わせました。現在のトマト作物系統の収量と生産性に重要な6つの遺伝子座を編集することで、野生のSolanumpimpinellifoliumの新たな家畜化が可能になったと報告します。設計されたS.pimpinellifoliumの形態は、果実のサイズ、数、栄養価とともに変更されました。野生の親と比較して、私たちの設計された系統は、果実のサイズが3倍に増加し、果実の数が10倍に増加しています。特に、果物のリコペンの蓄積は、広く栽培されているS. lycopersicumと比較して500％改善されています。私たちの結果は、野生植物に存在する遺伝的多様性を活用するための分子育種プログラムへの道を開きます。"]
[194,30518324,"plant","torenia (Torenia fournieri L.)","CRISPR;Cas9;","flavanone-3-hydroxylase","BMC plant biology","Application of the CRISPR/Cas9 system for modification of flower color in Torenia fournieri.",2018,"18(1):331","[Nishihara M  et al.]","Iwate Biotechnology Research Center, Kitakami, Iwate, Japan.",30518324,"10.1186/s12870-018-1539-3 ","BACKGROUND: CRISPR/Cas9 technology is one of the most powerful and useful tools for genome editing in various living organisms. In higher plants, the system has  been widely exploited not only for basic research, such as gene functional analysis, but also for applied research such as crop breeding. Although the CRISPR/Cas9 system has been used to induce mutations in genes involved in various plant developmental processes, few studies have been performed to modify the color of ornamental flowers. We therefore attempted to use this system to modify  flower color in the model plant torenia (Torenia fournieri L.). RESULTS: We attempted to induce mutations in the torenia flavanone 3-hydroxylase (F3H) gene,  which encodes a key enzyme involved in flavonoid biosynthesis. Application of the CRISPR/Cas9 system successfully generated pale blue (almost white) flowers at a high frequency (ca. 80% of regenerated lines) in transgenic torenia T0 plants. Sequence analysis of PCR amplicons by Sanger and next-generation sequencing revealed the occurrence of mutations such as base substitutions and insertions/deletions in the F3H target sequence, thus indicating that the obtained phenotype was induced by the targeted mutagenesis of the endogenous F3H  gene. CONCLUSIONS: These results clearly demonstrate that flower color modification by genome editing with the CRISPR/Cas9 system is easily and efficiently achievable. Our findings further indicate that this system may be useful for future research on flower pigmentation and/or functional analyses of additional genes in torenia.","torenia (Torenia fournieri L.)","背景：CRISPR / Cas9テクノロジーは、さまざまな生物のゲノム編集に最も強力で便利なツールの1つです。高等植物では、遺伝子機能解析などの基礎研究だけでなく、作物育種などの応用研究にも広く活用されています。CRISPR / Cas9システムは、さまざまな植物の発達過程に関与する遺伝子の変異を誘発するために使用されてきましたが、装飾用の花の色を変更するために行われた研究はほとんどありません。そのため、このシステムを使用して、モデル植物トレニア（Torenia fournieri L.）の花の色を変更しようとしました。結果：フラボノイド生合成に関与する重要な酵素をコードするトレニアフラバノン3-ヒドロキシラーゼ（F3H）遺伝子に変異を誘発しようとしました。CRISPR / Cas9システムの適用により、トランスジェニックトレニアT0植物において、高頻度（再生系統の約80％）で淡い青色（ほぼ白色）の花が正常に生成されました。サンガー法によるPCRアンプリコンの配列分析と次世代シーケンシングにより、F3H標的配列における塩基置換や挿入/欠失などの変異の発生が明らかになり、得られた表現型が内因性F3H遺伝子の標的変異誘発によって誘導されたことが示されました。結論：これらの結果は、CRISPR / Cas9システムを使用したゲノム編集による花の色の変更が簡単かつ効率的に達成できることを明確に示しています。我々の発見はさらに、このシステムが花の色素沈着および/またはトレニアにおける追加の遺伝子の機能分析に関する将来の研究に役立つ可能性があることを示しています。"]
[195,30086204,"plant","tragopogon","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase (TraPDS)","Molecular ecology resources","Application of CRISPR/Cas9 to Tragopogon (Asteraceae), an evolutionary model for  the study of polyploidy.",2018,"18(6):1427-1443","[Shan S  et al.]","University of Florida, Gainesville, FL, USA.",30086204,"10.1111/1755-0998.12935 ","Tragopogon (Asteraceae) is an excellent natural system for studies of recent polyploidy. Development of an efficient CRISPR/Cas9-based genome editing platform in Tragopogon will facilitate novel studies of the genetic consequences of polyploidy. Here, we report our initial results of developing CRISPR/Cas9 in Tragopogon. We have established a feasible tissue culture and transformation protocol for Tragopogon. Through protoplast transient assays, use of the TragCRISPR system (i.e. the CRISPR/Cas9 system adapted for Tragopogon) was capable of introducing site-specific mutations in Tragopogon protoplasts. Agrobacterium-mediated transformation with Cas9-sgRNA constructs targeting the phytoene desaturase gene (TraPDS) was implemented in this model polyploid system. Sequencing of PCR amplicons from the target regions indicated simultaneous mutations of two alleles and four alleles of TraPDS in albino shoots from Tragopogon porrifolius (2x) and Tragopogon mirus (4x), respectively. The average  proportions of successfully transformed calli with the albino phenotype were 87%  and 78% in the diploid and polyploid, respectively. This appears to be the first  demonstration of CRISPR/Cas9-based genome editing in any naturally formed neopolyploid system. Although a more efficient tissue culture system should be developed in Tragopogon, application of a robust CRISPR/Cas9 system will permit unique studies of biased fractionation, the gene-balance hypothesis and cytonuclear interactions in polyploids. In addition, the CRISPR/Cas9 platform enables investigations of those genes involved in phenotypic changes in polyploids and will also facilitate novel functional biology studies in Asteraceae. Our workflow provides a guide for applying CRISPR/Cas9 to other nongenetic model plant systems.","tragopogon","Tragopogon（キク科）は、最近の倍数性を研究するための優れた自然システムです。Tragopogonでの効率的なCRISPR / Cas9ベースのゲノム編集プラットフォームの開発は、倍数性の遺伝的影響の新しい研究を容易にします。ここでは、TragopogonでCRISPR / Cas9を開発した最初の結果を報告します。Tragopogonの実行可能な組織培養および変換プロトコルを確立しました。プロトプラスト一過性アッセイを通じて、TragCRISPRシステム（すなわち、Tragopogonに適合したCRISPR / Cas9システム）を使用することで、Tragopogonプロトプラストに部位特異的変異を導入することができました。フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（TraPDS）を標的とするCas9-sgRNAコンストラクトによるアグロバクテリウム媒介形質転換は、このモデル倍数体システムに実装されました。標的領域からのPCRアンプリコンの配列決定は、Tragopogon porrifolius（2x）およびTragopogon mirus（4x）からのアルビノシュートにおいて、TraPDSの2つの対立遺伝子と4つの対立遺伝子の同時変異をそれぞれ示しました。アルビノ表現型で正常に形質転換されたカルスの平均比率は、二倍体および倍数体でそれぞれ87％および78％であった。これは、自然に形成された新倍数体システムにおけるCRISPR / Cas9ベースのゲノム編集の最初のデモンストレーションのようです。より効率的な組織培養システムをTragopogonで開発する必要がありますが、堅牢なCRISPR / Cas9システムを適用することで、倍数体における偏りのある分画、遺伝子バランス仮説、細胞核相互作用の独自の研究が可能になります。さらに、CRISPR / Cas9プラットフォームは、倍数体の表現型の変化に関与する遺伝子の調査を可能にし、キク科の新しい機能生物学研究も促進します。私たちのワークフローは、CRISPR / Cas9を他の非遺伝子モデル植物システムに適用するためのガイドを提供します。"]
[196,30049895,"plant","Tripterygium wilfordii","CRISPR;Cas9;","sesquiterpene cyclase","Biochemical journal","Eudesmane-type sesquiterpene diols directly synthesized by a sesquiterpene cyclase in Tripterygium wilfordii.",2018,"475(17):2713-2725","[Tong YR et al.]","Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, China.",30049895,"10.1042/BCJ20180353 ","Cryptomeridiol, a typical eudesmane diol, is the active principle component of the antispasmodic Proximol. Although it has been used for many years, the biosynthesis pathway of cryptomeridiol has remained blur. Among terpenoid natural products, terpenoid cyclases are responsible for cyclization and generation of hydrocarbon backbones. The cyclization is mediated by carbocationic cascades and  ultimately terminated via deprotonation or nucleophilic capture. Isoprene precursors are, respectively, converted into hydrocarbons or hydroxylated backbones. A sesquiterpene cyclase in Tripterygium wilfordii (TwCS) was determined to directly catalyze (E,E)-farnesyl pyrophosphate (FPP) to unexpected  eudesmane diols, primarily cryptomeridiol. The function of TwCS was characterized by a modular pathway engineering system in Saccharomyces cerevisiae The major product determined by NMR spectroscopy turned out to be cryptomeridiol. This unprecedented production was further investigated in vitro, which verified that TwCS can directly produce eudesmane diols from FPP. Some key residues for TwCS catalysis were screened depending on the molecular model of TwCS and mutagenesis  studies. As cryptomeridiol showed a small amount of volatile and medicinal properties, the biosynthesis of cryptomeridiol was reconstructed in S. cerevisiae Optimized assays including modular pathway engineering and the CRISPR-cas9 system were successfully used to improve the yield of cryptomeridiol in the S. cerevisiae The best engineered strain TE9 (BY4741 erg9::Delta-200-176 rox1::mut/pYX212-IDI + TwCS/p424-tHMG1) ultimately produced 19.73 mg/l cryptomeridiol in a shake flask culture.","Tripterygium wilfordii","典型的なオイデスマンジオールであるクリプトメリジオールは、抗痙攣性プロキシモールの有効な主成分です。長年使用されてきましたが、クリプトメリジオールの生合成経路はあいまいなままです。テルペノイド天然物の中で、テルペノイドシクラーゼは、炭化水素骨格の環化と生成に関与しています。環化は、炭素カチオンカスケードによって媒介され、最終的には脱プロトン化または求核性捕捉によって終了します。イソプレン前駆体は、それぞれ、炭化水素またはヒドロキシル化骨格に変換されます。Tripterygium wilfordii（TwCS）のセスキテルペンシクラーゼは、（E、E）-ファルネシルピロリン酸（FPP）を予期しないオイデスマンジオール、主にクリプトメリジオールに直接触媒することが決定されました。TwCSの機能は、Saccharomycescerevisiaeのモジュラーパスウェイエンジニアリングシステムによって特徴づけられました。NMR分光法によって決定された主要な生成物はクリプトメリジオールであることが判明しました。この前例のない生産は、in vitroでさらに調査され、TwCSがFPPからオイデスマンジオールを直接生産できることが確認されました。TwCSの分子モデルと突然変異誘発研究に応じて、TwCS触媒作用のいくつかの重要な残基をスクリーニングしました。クリプトメリジオールは少量の揮発性および薬効を示したため、クリプトメリジオールの生合成はS. cerevisiaeで再構築されました。モジュラーパスウェイエンジニアリングおよびCRISPR-cas9システムを含む最適化されたアッセイは、S。cerevisiaeでのクリプトメリジオールの収量を改善するために首尾よく使用されました。改変株TE9（BY4741 erg9 :: Delta-200-176 rox1 :: mut / pYX212-IDI + TwCS / p424-tHMG1）は、最終的に振とうフラスコ培養で19.73 mg / lのクリプトメリジオールを産生しました。"]
[197,30477421,"plant","common wheat (Triticum aestivum L.)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","DA1","BMC plant biology","Targeted mutagenesis using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat.",2018,"18(1):302","[Zhang S et al.]","Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong, China.",30477421,"10.1186/s12870-018-1496-x ","BACKGROUND: Recently, the CRISPR/Cas9 system has been widely used to precisely edit plant genomes. Due to the difficulty in Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat, the reported applications in CRISPR/Cas9 system were all based on the biolistic transformation. RESULTS: In the present study, we efficiently applied targeted mutagenesis in common wheat (Triticum aestivum L.) protoplasts and transgenic T0 plants using the CRISPR/Cas9 system delivered via Agrobacterium tumefaciens. Seven target sites in three genes (Pinb, waxy and DA1) were selected to construct individual expression vectors. The activities of the sgRNAs were evaluated by transforming the constructed vectors into wheat protoplasts. Mutations in the targets were detected by Illumina sequencing. Genome editing, including insertions or deletions at the target sites, was found  in the wheat protoplast cells. The highest mutation efficiency was 6.8% in the DA1 gene. The CRISPR/Cas9 binary vector targeting the DA1 gene was then transformed into common wheat plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, resulting in efficient target gene editing in the T0 generation.  Thirteen mutant lines were generated, and the mutation efficiency was 54.17%. Mutations were found in the A and B genomes of the transgenic plants but not in the D genome. In addition, off-target mutations were not detected in regions that were highly homologous to the sgRNA sequences. CONCLUSIONS: Our results showed that our Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9 system can be used for targeted mutations and facilitated wheat genetic improvement.","wheat","背景：最近、CRISPR / Cas9システムは植物ゲノムを正確に編集するために広く使用されています。アグロバクテリウムを介した小麦の遺伝的形質転換は困難であるため、CRISPR / Cas9システムで報告されたアプリケーションはすべて生物リスト的形質転換に基づいていました。結果：本研究では、Agrobacteriumtumefaciensを介して配信されるCRISPR / Cas9システムを使用して、一般的な小麦（Triticum aestivum L.）プロトプラストおよびトランスジェニックT0植物に標的突然変異誘発を効率的に適用しました。3つの遺伝子（Pinb、waxy、DA1）の7つの標的部位を選択して、個々の発現ベクターを構築しました。構築されたベクターを小麦プロトプラストに変換することにより、sgRNAの活性を評価した。ターゲットの変異は、イルミナのシーケンスによって検出されました。標的部位での挿入または削除を含むゲノム編集が、小麦原形質細胞で見られた。最高の突然変異効率はDA1遺伝子で6.8％でした。次に、DA1遺伝子を標的とするCRISPR / Cas9バイナリーベクターは、Agrobacterium tumefaciensを介した形質転換によって一般的な小麦植物に形質転換され、T0世代で効率的な標的遺伝子編集が行われました。13の変異株が生成され、変異効率は54.17％でした。変異はトランスジェニック植物のAおよびBゲノムに見られたが、Dゲノムには見られなかった。さらに、sgRNA配列と高度に相同な領域ではオフターゲット変異は検出されませんでした。結論：私たちの結果は、私たちのアグロバクテリウムを介したCRISPR / Cas9システムが標的変異に使用でき、小麦の遺伝的改善を促進できることを示しました。"]
[198,29734518,"plant","Triticum aestivum","ZFN;","acetohydroxyacid synthase","Plant biotechnology journal","Zinc finger nuclease-mediated precision genome editing of an endogenous gene in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) using a DNA repair template.",2018,"16(12):2088-2101","[Ran Y et al.]","Genovo Biotechnology Co. Ltd, Tianjin, China.",29734518,"10.1111/pbi.12941 ","Sequence-specific nucleases have been used to engineer targeted genome modifications in various plants. While targeted gene knockouts resulting in loss  of function have been reported with relatively high rates of success, targeted gene editing using an exogenously supplied DNA repair template and site-specific  transgene integration has been more challenging. Here, we report the first application of zinc finger nuclease (ZFN)-mediated, nonhomologous end-joining (NHEJ)-directed editing of a native gene in allohexaploid bread wheat to introduce, via a supplied DNA repair template, a specific single amino acid change into the coding sequence of acetohydroxyacid synthase (AHAS) to confer resistance to imidazolinone herbicides. We recovered edited wheat plants having the targeted amino acid modification in one or more AHAS homoalleles via direct selection for resistance to imazamox, an AHAS-inhibiting imidazolinone herbicide. Using a cotransformation strategy based on chemical selection for an exogenous marker, we achieved a 1.2% recovery rate of edited plants having the desired amino acid change and a 2.9% recovery of plants with targeted mutations at the AHAS locus resulting in a loss-of-function gene knockout. The latter results demonstrate a broadly applicable approach to introduce targeted modifications into native genes for nonselectable traits. All ZFN-mediated changes were faithfully transmitted to the next generation.","wheat","配列特異的ヌクレアーゼは、さまざまな植物で標的ゲノム修飾を操作するために使用されてきました。機能の喪失をもたらす標的遺伝子ノックアウトは比較的高い成功率で報告されていますが、外因的に供給されたDNA修復テンプレートと部位特異的導入遺伝子統合を使用した標的遺伝子編集はより困難です。ここでは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を介した、非相同末端結合（NHEJ）による、同種六倍体パン小麦のネイティブ遺伝子の編集の最初のアプリケーションを報告し、提供されたDNA修復テンプレートを介して特定の単一アミノ酸を導入します。イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与するために、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）のコード配列に変更します。AHAS阻害イミダゾリノン除草剤であるイマザモックスに対する耐性を直接選択することにより、1つまたは複数のAHASホモ対立遺伝子に標的アミノ酸修飾を有する編集済み小麦植物を回収しました。外因性マーカーの化学的選択に基づく共形質転換戦略を使用して、目的のアミノ酸変化を有する編集された植物の1.2％の回収率と、AHAS遺伝子座に標的変異を有する植物の2.9％の回収率を達成しました。機能遺伝子ノックアウト。後者の結果は、選択不可能な特性のためにネイティブ遺伝子にターゲットを絞った変更を導入するための広く適用可能なアプローチを示しています。ZFNを介したすべての変更は、次世代に忠実に伝達されました。"]
[199,30627700,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","TaGW2; TaLpx-1; TaMLO","CRISPR journal","Transgenerational CRISPR-Cas9 Activity Facilitates Multiplex Gene Editing in Allopolyploid Wheat.",2018,"1(1):65-74","[Wang W et al.]","Kansas State University, Manhattan, KS, USA.",30627700,"10.1089/crispr.2017.0010 ","The CRISPR-Cas9-based multiplexed gene editing (MGE) provides a powerful method to modify multiple genomic regions simultaneously controlling different agronomic traits in crops. We applied the MGE construct built by combining the tandemly arrayed tRNA-gRNA units to generate heritable mutations in the TaGW2, TaLpx-1, and TaMLO genes of hexaploid wheat. The knockout mutations generated by this construct in all three homoeologous copies of one of the target genes, TaGW2, resulted in a substantial increase in seed size and thousand grain weight. We showed that the non-modified gRNA targets in the early generation plants can be edited by CRISPR-Cas9 in the following generations. Our results demonstrate that  transgenerational gene editing activity can serve as the source of novel variation in the progeny of CRISPR-Cas9-expressing plants and suggest that the Cas9-inducible trait transfer for crop improvement can be achieved by crossing the plants expressing the gene editing constructs with the lines of interest.","wheat","CRISPR-Cas9ベースの多重遺伝子編集（MGE）は、作物のさまざまな農業特性を同時に制御する複数のゲノム領域を変更するための強力な方法を提供します。タンデムに配列されたtRNA-gRNAユニットを組み合わせて構築されたMGEコンストラクトを適用して、六倍体小麦のTaGW2、TaLpx-1、およびTaMLO遺伝子に遺伝性変異を生成しました。標的遺伝子の1つであるTaGW2の3つの同祖コピーすべてでこのコンストラクトによって生成されたノックアウト変異は、種子サイズと千粒重の実質的な増加をもたらしました。初期世代の植物の非修飾gRNAターゲットは、次の世代のCRISPR-Cas9によって編集できることを示しました。私たちの結果は、世代を超えた遺伝子編集活動がCRISPR-Cas9発現植物の子孫における新しい変化の源として役立つことができることを示し、作物改善のためのCas9誘導性形質転移が遺伝子編集構築物を発現する植物を交配することによって達成できることを示唆します興味のある行で。"]
[200,28918562,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","wheat dehydration responsive element binding protein 2 (TaDREB2); wheat ethylene responsive factor 3 (TaERF3)","Functional & integrative genomics","CRISPR/Cas9 genome editing in wheat.",2018,"18(1):31-41","[Kim D et al.]","Montana State University, Bozeman, MT, USA.",28918562,"10.1007/s10142-017-0572-x ","Genome editing has been a long-term challenge for molecular biology research, particularly for plants possess complex genome. The recently discovered Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is a versatile tool for genome editing which enables editing of multiple genes based on the guidance of small RNAs. Even though the efficiency of CRISPR/Cas9 system has been shown with several studies from diploid plants, its application remains a challenge for plants with polyploid and complex genome. Here, we applied CRISPR/Cas9 genome editing system in wheat protoplast to conduct the targeted editing of stress-responsive transcription factor genes, wheat dehydration responsive element binding protein 2 (TaDREB2) and wheat ethylene responsive factor 3 (TaERF3). Targeted genome editing of TaDREB2 and TaERF3 was achieved with transient expression of small guide RNA and Cas9 protein in wheat protoplast. The effectiveness of mutagenesis in wheat protoplast was confirmed with restriction enzyme digestion assay, T7 endonuclease assay, and sequencing. Furthermore, several off-target regions for designed sgRNAs were analyzed, and the specificity of genome editing was confirmed with amplicon sequencing. Overall results suggested that CRISPR/Cas9 genome editing system can  easily be established on wheat protoplast and it has a huge potentiality for targeted manipulation of wheat genome for crop improvement purposes.","wheat","ゲノム編集は、分子生物学の研究、特に複雑なゲノムを持つ植物にとって、長期的な課題でした。最近発見されたクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムは、smallRNAのガイダンスに基づいて複数の遺伝子の編集を可能にするゲノム編集のための多目的ツールです。CRISPR / Cas9システムの効率は二倍体植物からのいくつかの研究で示されていますが、その応用は倍数体で複雑なゲノムを持つ植物にとって課題のままです。ここでは、小麦プロトプラストにCRISPR / Cas9ゲノム編集システムを適用して、ストレス応答性転写因子遺伝子、小麦脱水応答性要素結合タンパク質2（TaDREB2）、および小麦エチレン応答性因子3（TaERF3）のターゲット編集を行いました。TaDREB2およびTaERF3のターゲットゲノム編集は、小麦プロトプラストにおける小さなガイドRNAおよびCas9タンパク質の一過性発現によって達成されました。コムギプロトプラストにおける突然変異誘発の有効性は、制限酵素消化アッセイ、T7エンドヌクレアーゼアッセイ、および配列決定によって確認されました。さらに、設計されたsgRNAのいくつかのオフターゲット領域が分析され、ゲノム編集の特異性がアンプリコンシーケンスで確認されました。全体的な結果は、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムが小麦プロトプラスト上で容易に確立でき、作物改良目的で小麦ゲノムを標的に操作する大きな可能性を秘めていることを示唆しています。"]
[201,28921815,"plant","wheat","CRISPR/Cas9","alpha-gliadin genes","Plant biotechnology journal","Low-gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9.",2018,"16(4):902-910","[Sanchez-Leon S et al.]","Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC), Cordoba, Spain.",28921815,"10.1111/pbi.12837 ","Coeliac disease is an autoimmune disorder triggered in genetically predisposed individuals by the ingestion of gluten proteins from wheat, barley and rye. The alpha-gliadin gene family of wheat contains four highly stimulatory peptides, of  which the 33-mer is the main immunodominant peptide in patients with coeliac. We  designed two sgRNAs to target a conserved region adjacent to the coding sequence  for the 33-mer in the alpha-gliadin genes. Twenty-one mutant lines were generated, all showing strong reduction in alpha-gliadins. Up to 35 different genes were mutated in one of the lines of the 45 different genes identified in the wild type, while immunoreactivity was reduced by 85%. Transgene-free lines were identified, and no off-target mutations have been detected in any of the potential targets. The low-gluten, transgene-free wheat lines described here could be used to produce low-gluten foodstuff and serve as source material to introgress this trait into elite wheat varieties.","wheat","セリアック病は、小麦、大麦、ライ麦からのグルテンタンパク質の摂取によって遺伝的に素因のある個人に引き起こされる自己免疫障害です。小麦のα-グリアジン遺伝子ファミリーには、刺激性の高い4つのペプチドが含まれており、そのうち33-merがcoeliac患者の主要な免疫優勢ペプチドです。アルファグリアジン遺伝子の33-merのコード配列に隣接する保存領域をターゲットとする2つのsgRNAを設計しました。21の変異株が生成され、すべてアルファグリアジンの強い減少を示しました。野生型で同定された45の異なる遺伝子の系統の1つで、最大35の異なる遺伝子が変異し、免疫反応性は85％低下しました。トランスジーンフリーラインが特定され、潜在的なターゲットのいずれにもオフターゲット変異は検出されていません。ここで説明する低グルテン、トランスジーンフリーの小麦系統は、低グルテン食品を生産するために使用でき、この特性をエリート小麦品種に導入するための原料として機能します。"]
[202,29959585,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","3 Male sterile 45 (Ms45) homeologs","Plant molecular biology","Concurrent modifications in the three homeologs of Ms45 gene with CRISPR-Cas9 lead to rapid generation of male sterile bread wheat (Triticum aestivum L.).",2018,"97(4-5):371-383","[Singh M  et al.]","DuPont Pioneer, Johnston, IA, USA.",29959585,"10.1007/s11103-018-0749-2 ","KEY MESSAGE: Hexaploid bread wheat is not readily amenable to traditional mutagenesis approaches. In this study, we show efficient utilization of CRISPR-Cas system and Next Generation Sequencing for mutant analysis in wheat. Identification and manipulation of male fertility genes in hexaploid bread wheat  is important for understanding the molecular basis of pollen development and to obtain novel sources of nuclear genetic male sterility (NGMS). The maize Male sterile 45 (Ms45) gene encodes a strictosidine synthase-like enzyme and has been  shown to be required for male fertility. To investigate the role of Ms45 gene in  wheat, mutations in the A, B and D homeologs were produced using CRISPR-Cas9. A variety of mutations in the three homeologs were recovered, including a plant from two different genotypes each with mutations in all three homeologs. Genetic  analysis of the mutations demonstrated that all three wheat Ms45 homeologs contribute to male fertility and that triple homozygous mutants are required to abort pollen development and achieve male sterility. Further, it was demonstrated that a wild-type copy of Ms45 gene from rice was able to restore fertility to these wheat mutant plants. Taken together, these observations provide insights into the conservation of MS45 function in a polyploid species. Ms45 based NGMS can be potentially utilized for a Seed Production Technology (SPT)-like hybrid seed production system in wheat.","wheat","重要なメッセージ：六倍体のパン小麦は、従来の突然変異誘発アプローチに容易に適応できません。この研究では、小麦の変異体分析のためのCRISPR-Casシステムと次世代シーケンシングの効率的な利用を示しています。六倍体パン小麦の雄性生殖遺伝子の同定と操作は、花粉発生の分子基盤を理解し、核遺伝的雄性不稔（NGMS）の新しい源を得るために重要です。トウモロコシの男性無菌45（Ms45）遺伝子は、ストリクトシジンシンターゼ様酵素をコードしており、男性の生殖能力に必要であることが示されています。小麦におけるMs45遺伝子の役割を調査するために、CRISPR-Cas9を使用して、A、B、およびDホメオログの変異を生成しました。3つのホメオログすべてに変異がある2つの異なる遺伝子型からの植物を含む、3つのホメオログのさまざまな変異が回収されました。突然変異の遺伝分析は、3つすべての小麦Ms45ホメオログが男性の生殖能力に寄与すること、および花粉の発達を中止して男性の不妊を達成するためにトリプルホモ接合変異体が必要であることを示した。さらに、米からのMs45遺伝子の野生型コピーが、これらの小麦変異植物の生殖能力を回復できることが実証された。まとめると、これらの観察結果は、倍数体種におけるMS45機能の保存に関する洞察を提供します。Ms45ベースのNGMSは、小麦の種子生産技術（SPT）のようなハイブリッド種子生産システムに利用できる可能性があります。"]
[203,30258105,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","TaGASR7","Scientific reports","Biolistic-delivery-based transient CRISPR/Cas9 expression enables in planta genome editing in wheat.",2018,"8(1):14422","[Hamada H et al.]","KANEKA CORPORATION, Takasago, Japan.",30258105,"10.1038/s41598-018-32714-6 ","The current application of genome editing to crop plants is limited to cultivars  that are amenable to in vitro culture and regeneration. Here, we report an in planta genome-editing which does not require callus culture and regeneration. Shoot apical meristems (SAMs) contain a subepidermal cell layer, L2, from which germ cells later develop during floral organogenesis. The biolistic delivery of gold particles coated with plasmids expressing CRISPR/Cas9 components designed to target TaGASR7 were bombarded into SAM-exposed embryos of imbibed seeds. Bombarded embryos showing transient GFP expression within SAM were selected and grown into adult plants. Mutations in the target gene were assessed in fifth-leaf tissue by cleaved amplified polymorphic sequence analysis. Eleven (5.2%) of the 210 bombarded plants carried mutant alleles, and the mutations of three (1.4%) of these were inherited in the next generation. Genotype analysis of T1 plants identified plants homozygous for the three homeologous genes, which were all derived from one T0 plant. These plants showed no detectable integration of the Cas9 and guide RNA genes, indicating that transient expression of CRISPR/Cas9 introduced the mutations. Together, our current method can be used to achieve in  planta genome editing in wheat using CRISPR/Cas9 and suggests possible applications to other recalcitrant plant species and variations.","wheat","作物植物へのゲノム編集の現在の適用は、invitroでの培養と再生に適した栽培に限定されています。ここでは、カルスの培養と再生を必要としない植物内ゲノム編集について報告します。シュート頂端メリステム（SAM）には、表皮下細胞層L2が含まれており、そこから生殖細胞が花の器官形成中に発達します。TaGASR7を標的とするように設計されたCRISPR / Cas9成分を発現するプラスミドでコーティングされた金粒子の生物学的送達を、吸収された種子のSAMに曝露された胚に衝撃を与えた。SAM内で一過性のGFP発現を示す衝撃を受けた胚を選択し、成体植物に成長させました。標的遺伝子の変異は、切断された増幅多型配列分析によって第5葉組織で評価されました。爆撃された210の植物のうち11（5.2％）は変異対立遺伝子を持っており、これらのうち3（1.4％）の変異は次世代に受け継がれました。T1植物の遺伝子型分析により、3つの同種遺伝子がホモ接合である植物が特定されました。これらはすべて1つのT0植物に由来します。これらの植物は、Cas9およびガイドRNA遺伝子の検出可能な統合を示さず、CRISPR / Cas9の一過性発現が変異を導入したことを示しています。一緒に、私たちの現在の方法は、CRISPR / Cas9を使用して小麦のプランタゲノム編集を達成するために使用することができ、他の扱いにくい植物種およびバリエーションへの可能なアプリケーションを提案します。"]
[204,29695804,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;TALENs;","DsRed; wheat genes (TaLox2;  TaUbiL1)","Scientific reports","Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.",2018,"8(1):6502","[Bhowmik P  et al.]","National Research Council Canada, Saskatoon, SK, Canada.",29695804,"10.1038/s41598-018-24690-8 ","CRISPR/Cas9 genome editing is a transformative technology that will facilitate the development of crops to meet future demands. However, application of gene editing is hindered by the long life cycle of many crop species and because desired genotypes generally require multiple generations to achieve. Single-celled microspores are haploid cells that can develop into double haploid  plants and have been widely used as a breeding tool to generate homozygous plants within a generation. In this study, we combined the CRISPR/Cas9 system with microspore technology and developed an optimized haploid mutagenesis system to induce genetic modifications in the wheat genome. We investigated a number of factors that may affect the delivery of CRISPR/Cas9 reagents into microspores and found that electroporation of a minimum of 75,000 cells using 10-20 microg DNA and a pulsing voltage of 500 V is optimal for microspore transfection using the Neon transfection system. Using multiple Cas9 and sgRNA constructs, we present evidence for the seamless introduction of targeted modifications in an exogenous  DsRed gene and two endogenous wheat genes, including TaLox2 and TaUbiL1. This study demonstrates the value and feasibility of combining microspore technology and CRISPR/Cas9-based gene editing for trait discovery and improvement in plants.","wheat","CRISPR / Cas9ゲノム編集は、将来の需要を満たすために作物の開発を容易にする革新的な技術です。ただし、遺伝子編集の適用は、多くの作物種の長いライフサイクルによって妨げられ、目的の遺伝子型を達成するには一般に複数の世代が必要になるためです。単細胞小胞子は、二重半数体植物に成長することができる半数体細胞であり、世代内でホモ接合性植物を生成するための育種ツールとして広く使用されています。この研究では、CRISPR / Cas9システムを小胞子技術と組み合わせ、小麦ゲノムに遺伝子改変を誘導するための最適化された一倍体突然変異誘発システムを開発しました。小胞子へのCRISPR / Cas9試薬の送達に影響を与える可能性のあるいくつかの要因を調査し、10〜20μgのDNAと500Vのパルス電圧を使用した最低75,000細胞のエレクトロポレーションが、ネオントランスフェクションを使用した小胞子トランスフェクションに最適であることを発見しました。システム。複数のCas9およびsgRNAコンストラクトを使用して、外因性DsRed遺伝子およびTaLox2とTaUbiL1を含む2つの内因性小麦遺伝子に標的修飾をシームレスに導入する証拠を提示します。この研究は、小胞子技術とCRISPR / Cas9ベースの遺伝子編集を組み合わせて植物の形質の発見と改善を行うことの価値と実現可能性を示しています。"]
[205,30136108,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","TaGW2","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","Gene editing and mutagenesis reveal inter-cultivar differences and additivity in  the contribution of TaGW2 homoeologues to grain size and weight in wheat.",2018,"131(11):2463-2475","[Wang W et al.]","Kansas State University, Manhattan, KS, USA.",30136108,"10.1007/s00122-018-3166-7 ","KEY MESSAGE: CRISPR-Cas9-based genome editing and EMS mutagenesis revealed inter-cultivar differences and additivity in the contribution of TaGW2 homoeologues to grain size and weight in wheat. The TaGW2 gene homoeologues have  been reported to be negative regulators of grain size (GS) and thousand grain weight (TGW) in wheat. However, the contribution of each homoeologue to trait variation among different wheat cultivars is not well documented. We used the CRISPR-Cas9 system and TILLING to mutagenize each homoeologous gene copy in cultivars Bobwhite and Paragon, respectively. Plants carrying single-copy nonsense mutations in different genomes showed different levels of GS/TGW increase, with TGW increasing by an average of 5.5% (edited lines) and 5.3% (TILLING mutants). In any combination, the double homoeologue mutants showed higher phenotypic effects than the respective single-genome mutants. The double mutants had on average 12.1% (edited) and 10.5% (TILLING) higher TGW with respect to wild-type lines. The highest increase in GS and TGW was shown for triple mutants of both cultivars, with increases in 16.3% (edited) and 20.7% (TILLING) in TGW. The additive effects of the TaGW2 homoeologues were also demonstrated by  the negative correlation between the functional gene copy number and GS/TGW in Bobwhite mutants and an F2 population. The highest single-genome increases in GS  and TGW in Paragon and Bobwhite were obtained by mutations in the B and D genomes, respectively. These inter-cultivar differences in the phenotypic effects between the TaGW2 gene homoeologues coincide with inter-cultivar differences in the homoeologue expression levels. These results indicate that GS/TGW variation in wheat can be modulated by the dosage of homoeologous genes with inter-cultivar differences in the magnitude of the individual homoeologue effects.","wheat","重要なメッセージ：CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集とEMS変異誘発により、コムギの粒径と重量に対するTaGW2ホモエログの寄与における品種間の違いと相加性が明らかになりました。TaGW2遺伝子ホモエログは、コムギの穀粒サイズ（GS）および千粒重（TGW）の負の調節因子であると報告されています。ただし、異なるコムギ品種間の形質の変化に対する各ホモエログの寄与は十分に文書化されていません。CRISPR-Cas9システムとTILLINGを使用して、それぞれ栽培品種BobwhiteとParagonの同祖遺伝子コピーを変異誘発しました。異なるゲノムにシングルコピーのナンセンス変異を有する植物は、異なるレベルのGS / TGWの増加を示し、TGWは平均5.5％（編集された行）および5.3％（TILLING変異体）増加しました。どの組み合わせでも、ダブルホモエログ変異体は、それぞれのシングルゲノム変異体よりも高い表現型効果を示しました。二重変異体は、野生型系統と比較して、平均して12.1％（編集済み）および10.5％（TILLING）高いTGWを持っていました。GSとTGWの最大の増加は、両方の栽培品種の三重変異体で示され、TGWでは16.3％（編集）と20.7％（耕作）の増加が見られました。TaGW2ホモエログの相加効果は、Bobwhite変異体とF2集団における機能的遺伝子コピー数とGS / TGWの間の負の相関によっても示されました。ParagonとBobwhiteのGSとTGWで最も高い単一ゲノムの増加は、それぞれBとDのゲノムの突然変異によって得られました。TaGW2遺伝子ホモエログ間の表現型効果のこれらの品種間差異は、ホモエログ発現レベルの品種間差異と一致します。これらの結果は、小麦のGS / TGWの変動は、個々の同種異系の影響の大きさに異文化間の違いがある同祖遺伝子の投与量によって調節できることを示しています。"]
[206,29499560,"plant","wheat","Agroinfiltration;","green fluorescent protein","Virology","Octapartite negative-sense RNA genome of High Plains wheat mosaic virus encodes two suppressors of RNA silencing.",2018,"518:152-162","[Gupta AK et al.]","University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA.",29499560,"10.1016/j.virol.2018.02.013 ","High Plains wheat mosaic virus (HPWMoV, genus Emaravirus; family Fimoviridae), transmitted by the wheat curl mite (Aceria tosichella Keifer), harbors a monocistronic octapartite single-stranded negative-sense RNA genome. In this study, putative proteins encoded by HPWMoV genomic RNAs 2-8 were screened for potential RNA silencing suppression activity by using a green fluorescent protein-based reporter agroinfiltration assay. We found that proteins encoded by  RNAs 7 (P7) and 8 (P8) suppressed silencing induced by single- or double-stranded RNAs and efficiently suppressed the transitive pathway of RNA silencing. Additionally, a Wheat streak mosaic virus (WSMV, genus Tritimovirus; family Potyviridae) mutant lacking the suppressor of RNA silencing (DeltaP1) but having  either P7 or P8 from HPWMoV restored cell-to-cell and long-distance movement in wheat, thus indicating that P7 or P8 rescued silencing suppressor-deficient WSMV. Furthermore, HPWMoV P7 and P8 substantially enhanced the pathogenicity of Potato  virus X in Nicotiana benthamiana. Collectively, these data demonstrate that the octapartite genome of HPWMoV encodes two suppressors of RNA silencing.","wheat","ハイプレーンズ小麦モザイクウイルス（HPWMoV、エマラウイルス属、フィモビリダエ科）は、小麦カールマイト（Aceria tosichella Keifer）によって伝染し、モノシストロン性の八分節の一本鎖ネガティブセンスRNAゲノムを持っています。この研究では、HPWMoVゲノムRNA 2〜8によってコードされる推定タンパク質を、緑色蛍光タンパク質ベースのレポーターアグロインフィルトレーションアッセイを使用して、潜在的なRNAサイレンシング抑制活性についてスクリーニングしました。RNA 7（P7）および8（P8）によってコードされるタンパク質が、一本鎖または二本鎖RNAによって誘発されるサイレンシングを抑制し、RNAサイレンシングの遷移経路を効率的に抑制することを発見しました。さらに、コムギ条斑モザイクウイルス（WSMV、トリチモウイルス属、ポティウイルス科）変異体は、RNAサイレンシングのサプレッサー（DeltaP1）を欠いているが、HPWMoVからのP7またはP8のいずれかを持っているため、小麦の細胞間および長距離の動きが回復したことを示しています。そのP7またはP8はサイレンシングサプレッサー欠損WSMVを救出しました。さらに、HPWMoV P7およびP8は、NicotianabenthamianaにおけるポテトウイルスXの病原性を大幅に強化しました。まとめると、これらのデータは、HPWMoVのオクタパートゲノムがRNAサイレンシングの2つのサプレッサーをエンコードしていることを示しています。"]
[207,30272679,"plant","wheat; rice; potato","Cas9;"," ","Nature biotechnology","Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A.",2018,null,"[Zong Y et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30272679,"10.1038/nbt.4261 ","Base editors (BEs) have been used to create C-to-T substitutions in various organisms. However, editing with rat APOBEC1-based BE3 is limited to a 5-nt sequence editing window and is inefficient in GC contexts. Here, we show that a base editor fusion protein composed of Cas9 nickase and human APOBEC3A (A3A-PBE)  converts cytidine to thymidine efficiently in wheat, rice and potato with a 17-nucleotide editing window at all examined sites, independent of sequence context.","wheat; rice; potato","ベースエディタ（BE）は、さまざまな生物でCからTへの置換を作成するために使用されてきました。ただし、ラットAPOBEC1ベースのBE3を使用した編集は、5 ntのシーケンス編集ウィンドウに制限されており、GCコンテキストでは非効率的です。ここでは、Cas9ニッカーゼとヒトAPOBEC3A（A3A-PBE）で構成されるベースエディター融合タンパク質が、配列のコンテキストに関係なく、すべての検査部位で17ヌクレオチドの編集ウィンドウを使用して、小麦、米、ジャガイモでシチジンをチミジンに効率的に変換することを示します。"]
[208,30366497,"plant"," ","Cas9;TALENs;"," ","Biochemistry","Efficient and Orthogonal Transcription Regulation by Chemically Inducible Artificial Transcription Factors.",2018,"57(45):6452-6459","[Nomura W  et al.]","Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.",30366497,"10.1021/acs.biochem.8b00741 ","The DNA-binding specificity of genome editing tools can be applied to gene regulation. Recently, multiple artificial transcription factors (ATFs) were shown to synergistically and efficiently regulate gene expression. Chemically triggered protein associations are useful for functional regulation at specific timings. A  combination of several inducible protein association systems could enable the regulation of multiple genes at different loci with independent timing. We applied the FKBP-rapamycin-FRB and GAI-gibberellin-GID systems for gene regulation using multiple TALEs and dCas9. By the combined use of currently available systems, reporter gene assays were performed; the results indicated that gene expression was regulated by rapamycin or gibberellin in the presence of the FRB or GAI effector domains, respectively. Furthermore, the activation of endogenous genes was differentially regulated by the system. This success suggests the usability of the chemically inducible multiple ATFs for the time-dependent regulation of multiple genes, such as the case for cellular phenomena that are dependent on the programmable timing of expression and the differential expression of multiple genes.",null,"ゲノム編集ツールのDNA結合特異性は、遺伝子調節に適用できます。最近、複数の人工転写因子（ATF）が相乗的かつ効率的に遺伝子発現を調節することが示されました。化学的に誘発されたタンパク質の会合は、特定のタイミングでの機能調節に有用です。いくつかの誘導性タンパク質会合システムの組み合わせは、独立したタイミングで異なる遺伝子座で複数の遺伝子の調節を可能にする可能性があります。複数のTALEとdCas9を使用した遺伝子調節に、FKBP-ラパマイシン-FRBおよびGAI-ギベレリン-GIDシステムを適用しました。現在利用可能なシステムを組み合わせて使用​​することにより、レポーター遺伝子アッセイが実施されました。結果は、遺伝子発現が、FRBまたはGAIエフェクタードメインの存在下で、それぞれラパマイシンまたはジベレリンによって調節されることを示した。さらに、内因性遺伝子の活性化は、システムによって異なって調節されていた。この成功は、複数の遺伝子のプログラム可能なタイミングおよび複数の遺伝子の差次的発現に依存する細胞現象の場合など、複数の遺伝子の時間依存性調節のための化学的に誘導可能な複数のATFの有用性を示唆している。"]
[209,29946325,"plant"," ","CRISPR;","vip1-2","Frontiers in plant science","VIP1 and Its Homologs Are Not Required for Agrobacterium-Mediated Transformation, but Play a Role in Botrytis and Salt Stress Responses.",2018,"9:749","[Lapham R et al.]","Purdue University, West Lafayette, IN, USA.",29946325,"10.3389/fpls.2018.00749 ","The bZIP transcription factor VIP1 interacts with the Agrobacterium virulence protein VirE2, but the role of VIP1 in Agrobacterium-mediated transformation remains controversial. Previously tested vip1-1 mutant plants produce a truncated protein containing the crucial bZIP DNA-binding domain. We generated the CRISPR/Cas mutant vip1-2 that lacks this domain. The transformation susceptibility of vip1-2 and wild-type plants is similar. Because of potential functional redundancy among VIP1 homologs, we tested transgenic lines expressing  VIP1 fused to a SRDX repression domain. All VIP1-SRDX transgenic lines showed wild-type levels of transformation, indicating that neither VIP1 nor its homologs are required for Agrobacterium-mediated transformation. Because VIP1 is involved  in innate immune response signaling, we tested the susceptibility of vip1 mutant  and VIP1-SRDX plants to Pseudomonas syringae and Botrytis cinerea. vip1 mutant and VIP1-SRDX plants show increased susceptibility to B. cinerea but not to P. syringae infection, suggesting a role for VIP1 in B. cinerea, but not in P. syringae, defense signaling. B. cinerea susceptibility is dependent on abscisic acid (ABA) which is also important for abiotic stress responses. The germination  of vip1 mutant and VIP1-SRDX seeds is sensitive to exogenous ABA, suggesting a role for VIP1 in response to ABA. vip1 mutant and VIP1-SRDX plants show increased tolerance to growth in salt, indicating a role for VIP1 in response to salt stress.",null,"bZIP転写因子VIP1はAgrobacteriumの病原性タンパク質VirE2と相互作用しますが、Agrobacteriumを介した形質転換におけるVIP1の役割については議論の余地があります。以前にテストされたvip1-1変異体植物は、重要なbZIPDNA結合ドメインを含む短縮型タンパク質を生成します。このドメインを欠くCRISPR / Cas変異体vip1-2を生成しました。vip1-2と野生型植物の形質転換感受性は類似しています。VIP1ホモログ間の潜在的な機能的冗長性のため、SRDX抑制ドメインに融合したVIP1を発現するトランスジェニック系統をテストしました。すべてのVIP1-SRDXトランスジェニック系統は野生型レベルの形質転換を示し、VIP1もそのホモログもアグロバクテリウムを介した形質転換に必要ではないことを示しています。VIP1は生来の免疫応答シグナル伝達に関与しているため、vip1変異体とVIP1-SRDX植物のPseudomonassyringaeとBotrytiscinereaに対する感受性をテストしました。vip1変異体およびVIP1-SRDX植物は、B。cinereaに対する感受性の増加を示しますが、P。syringae感染に対する感受性は増加しません。これは、B。cinereaにおけるVIP1の役割を示唆していますが、P。syringaeにおける防御シグナル伝達ではありません。B. cinereaの感受性は、非生物的ストレス応答にも重要なアブシジン酸（ABA）に依存しています。vip1変異体とVIP1-SRDX種子の発芽は、外因性ABAに敏感であり、ABAに応答したVIP1の役割を示唆しています。vip1変異体およびVIP1-SRDX植物は、塩分での成長に対する耐性の増加を示し、塩分ストレスに応答したVIP1の役割を示しています。"]
[210,29197638,"plant"," ","CRISPR;Cas9;TALENs;"," ","Molecular plant","Robust Transcriptional Activation in Plants Using Multiplexed CRISPR-Act2.0 and mTALE-Act Systems.",2018,"11(2):245-256","[Lowder LG et al.]","East Carolina University, Greenville, NC, USA.",29197638,"10.1016/j.molp.2017.11.010 ","User-friendly tools for robust transcriptional activation of endogenous genes are highly demanded in plants. We previously showed that a dCas9-VP64 system consisting of the deactivated CRISPR-associated protein 9 (dCas9) fused with four tandem repeats of the transcriptional activator VP16 (VP64) could be used for transcriptional activation of endogenous genes in plants. In this study, we developed a second generation of vector systems for enhanced transcriptional activation in plants. We tested multiple strategies for dCas9-based transcriptional activation, and found that simultaneous recruitment of VP64 by dCas9 and a modified guide RNA scaffold gRNA2.0 (designated CRISPR-Act2.0) yielded stronger transcriptional activation than the dCas9-VP64 system. Moreover, we developed a multiplex transcription activator-like effector activation (mTALE-Act) system for simultaneous activation of up to four genes in plants. Our results suggest that mTALE-Act is even more effective than CRISPR-Act2.0 in most  cases tested. In addition, we explored tissue-specific gene activation using positive feedback loops. Interestingly, our study revealed that certain endogenous genes are more amenable than others to transcriptional activation, and tightly regulated genes may cause target gene silencing when perturbed by activation probes. Hence, these new tools could be used to investigate gene regulatory networks and their control mechanisms. Assembly of multiplex CRISPR-Act2.0 and mTALE-Act systems are both based on streamlined and PCR-independent Golden Gate and Gateway cloning strategies, which will facilitate transcriptional activation applications in both dicots and monocots.",null,"内因性遺伝子の強力な転写活性化のためのユーザーフレンドリーなツールは、植物で非常に求められています。転写活性化因子VP16（VP64）の4つのタンデムリピートと融合した非活性化CRISPR関連タンパク質9（dCas9）からなるdCas9-VP64システムが、植物の内因性遺伝子の転写活性化に使用できることを以前に示しました。この研究では、植物の転写活性化を強化するための第2世代のベクターシステムを開発しました。dCas9ベースの転写活性化について複数の戦略をテストし、dCas9と変更されたガイドRNAスキャフォールドgRNA2.0（CRISPR-Act2.0と指定）によるVP64の同時リクルートにより、dCas9-VP64システムよりも強力な転写活性化が得られることを発見しました。さらに、植物の最大4つの遺伝子を同時に活性化するための多重転写活性化因子様エフェクター活性化（mTALE-Act）システムを開発しました。私たちの結果は、テストされたほとんどの場合、mTALE-ActがCRISPR-Act2.0よりもさらに効果的であることを示唆しています。さらに、ポジティブフィードバックループを使用して組織特異的な遺伝子活性化を調査しました。興味深いことに、私たちの研究では、特定の内因性遺伝子が他の遺伝子よりも転写活性化を受けやすく、厳密に制御された遺伝子が活性化プローブによって摂動されたときに標的遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性があることが明らかになりました。したがって、これらの新しいツールを使用して、遺伝子調節ネットワークとその制御メカニズムを調査することができます。マルチプレックスCRISPR-Act2.0およびmTALE-Actシステムのアセンブリは、どちらも合理化されたPCRに依存しないゴールデンゲートおよびゲートウェイクローニング戦略に基づいており、双子葉植物と単子葉植物の両方で転写活性化アプリケーションを容易にします。"]
[211,31245713,"plant"," ","CRISPR;Cas9;"," ","Plant direct","CRISPR/Cas9-mediated resistance to cauliflower mosaic virus.",2018,"2(3):e00047","[Liu H et al.]","Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA.",31245713,"10.1002/pld3.47 ","Viral diseases are a leading cause of worldwide yield losses in crop production.  Breeding of resistance genes (R gene) into elite crop cultivars has been the standard and most cost-effective practice. However, R gene-mediated resistance is limited by the available R genes within genetic resources and in many cases, by strain specificity. Therefore, it is important to generate new and broad-spectrum antiviral strategies. The CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced palindromic repeat, CRISPR-associated) editing system has been employed to confer resistance to human viruses and several plant single-stranded DNA geminiviruses,  pointing out the possible application of the CRISPR-Cas9 system for virus control. Here, we demonstrate that strong viral resistance to cauliflower mosaic  virus (CaMV), a pararetrovirus with a double-stranded DNA genome, can be achieved through Cas9-mediated multiplex targeting of the viral coat protein sequence. We  further show that small interfering RNAs (siRNA) are produced and mostly map to the 3' end of single-guide RNAs (sgRNA), although very low levels of siRNAs map to the spacer region as well. However, these siRNAs are not responsible for the inhibited CaMV infection because there is no resistance if Cas9 is not present. We have also observed edited viruses in systematically infected leaves in some transgenic plants, with short deletions or insertions consistent with Cas9-induced DNA breaks at the sgRNA target sites in coat protein coding sequence. These edited coat proteins, in most cases, led to earlier translation stop and thus, nonfunctional coat proteins. We also recovered wild-type CP sequence in these infected transgenic plants, suggesting these edited viral genomes were packaged by wild-type coat proteins. Our data demonstrate that the CRISPR-Cas9 system can be used for virus control against plant pararetroviruses with further modifications.",null,"ウイルス性疾患は、作物生産における世界的な収量損失の主な原因です。耐性遺伝子（R遺伝子）をエリート作物栽培品種に育種することは、標準的で最も費用効果の高い方法です。ただし、R遺伝子を介した耐性は、遺伝資源内で利用可能なR遺伝子によって、また多くの場合、菌株の特異性によって制限されます。したがって、新しい幅広い抗ウイルス戦略を生み出すことが重要です。CRISPR-Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート、CRISPR関連）編集システムは、ヒトウイルスおよびいくつかの植物一本鎖DNAジェミニウイルスに対する耐性を付与するために採用されており、ウイルス制御のためのCRISPR-Cas9システムの可能なアプリケーションを指摘しています。ここでは、二本鎖DNAゲノムを持つパラレトロウイルスであるカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）に対する強力なウイルス耐性が、ウイルスコートタンパク質配列のCas9を介したマルチプレックスターゲティングによって達成できることを示します。さらに、低分子干渉RNA（siRNA）が生成され、ほとんどがシングルガイドRNA（sgRNA）の3 '末端にマッピングされることを示しますが、非常に低レベルのsiRNAもスペーサー領域にマッピングされます。ただし、Cas9が存在しない場合は耐性がないため、これらのsiRNAはCaMV感染の抑制の原因ではありません。また、いくつかのトランスジェニック植物の系統的に感染した葉で編集されたウイルスが観察され、コートタンパク質コード配列のsgRNA標的部位でのCas9誘導DNA切断と一致する短い削除または挿入があります。これらの編集されたコートタンパク質は、ほとんどの場合、早期の翻訳停止につながり、したがって機能しないコートタンパク質につながりました。また、これらの感染したトランスジェニック植物で野生型CP配列を回収しました。これは、これらの編集されたウイルスゲノムが野生型コートタンパク質によってパッケージ化されていることを示唆しています。私たちのデータは、CRISPR-Cas9システムが植物パラレトロウイルスに対するウイルス制御に使用できることを示しています。"]
[212,29463822,"plant"," ","CRISPR;","PPO","Scientific reports","True gene-targeting events by CRISPR/Cas-induced DSB repair of the PPO locus with an ectopically integrated repair template.",2018,"8(1):3338","[de Pater S  et al.]","Leiden University, Leiden, The Netherlands.",29463822,"10.1038/s41598-018-21697-z ","In recent years, several tools have become available for improved gene-targeting  (GT) in plants. DNA breaks at specific sites activate local DNA repair and recombination, including recombination with ectopic sequences leading to GT. Large-scale transformation with the repair template can be avoided by pre-insertion of the repair template in the genome and liberation by sequence-specific nucleases (in planta GT procedure). Here, we tested whether release of the repair template was required for GT. Plants were transformed with  constructs encoding a CRISPR/Cas nuclease with a recognition site in the endogenous PPO gene and a repair template harboring a 5' truncated PPO gene with  two amino acid substitutions rendering the enzyme insensitive to the herbicide butafenacil. Selection resulted in so-called true GT events, repaired via homologous recombination at both ends of the gene and transmitted to the next generation. As the template was surrounded by geminiviral LIR sequences, we also  tested whether replication of the template could be induced by crossing-in an integrated geminivirus REP gene. However, we could not find evidence for repair template replication by REP and we obtained similar numbers of GT events in these plants. Thus, GT is possible without any further processing of the pre-inserted repair template.",null,"近年、植物の遺伝子ターゲティング（GT）を改善するためのいくつかのツールが利用可能になりました。特定の部位でのDNA切断は、GTにつながる異所性配列との組換えを含む局所的なDNA修復と組換えを活性化します。修復テンプレートを使用した大規模な変換は、修復テンプレートをゲノムに事前に挿入し、配列固有のヌクレアーゼによって解放することで回避できます（プランタGT手順）。ここでは、GTに修復テンプレートのリリースが必要かどうかをテストしました。植物は、内因性PPO遺伝子に認識部位を持つCRISPR / Casヌクレアーゼをコードする構築物と、2つのアミノ酸置換を持つ5 '短縮型PPO遺伝子を含む修復テンプレートで形質転換され、酵素は除草剤ブタフェナシルに対して非感受性になりました。選択の結果、いわゆる真のGTイベントが発生し、遺伝子の両端で相同組換えによって修復され、次世代に伝達されました。テンプレートはジェミニウイルスLIRシーケンスに囲まれているため、統合されたジェミニウイルスREP遺伝子をクロスインすることでテンプレートの複製を誘導できるかどうかもテストしました。ただし、REPによる修復テンプレートの複製の証拠は見つかりませんでした。また、これらのプラントで同様の数のGTイベントを取得しました。したがって、GTは、事前に挿入された修復テンプレートをさらに処理しなくても可能です。"]